FORSCHUNGSBERICHT DES LANDES NORDRHEIN-WESTF ALEN I Nr. 3027 Fachgruppe Medizin Herausgegeben vom Minister fUr Wissenschaft und Forschung Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Gunther Gillissen Abteilung Medizinische Mikrobiologie der Medizinischen F akulHit der Rhein. -Westf. Techn. Hochschule Aachen Verteilungsmuster von Lymphozyten-Klassen und PHA-Reaktivitat peripherer Lymphozyten bei Patienten mit malignen Tumoren Westdeutscher Verlag 1981 CIP-Kurztite1aufnahme der Deutschen Bib1iothek Gi11issen. GUnther: Vertei1ungsmuster von Lymphozyten-K1assen und PHA-Reaktivitat peripherer Lymphozyten bei Pa tienten mit ma1ignen Tumoren / GUnther Gi11issen. - Op1aden : Westdeutscher Ver1ag, 1981. (Forschungsberichte des Landes Nordrhein Westfa1en ; Nr. 3027 : Fachgruppe Medizin) ISBN-13: 978-3-531-63027-2 e-ISBN-13: 978-3-322-87540-2 DOl: 10.1007/978-3-322-87540-2 NE: Nordrhein-Westfa1en: Forschungsberichte des Landes ••• © 1981 by Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen Gesamtherstellung: Westdeutscher Verlag ISBN-13: 978-3-531-03027-2 Inhalt 1.0.0 - Vorwort 2 2.0.0 - Entwicklung einer neuen Methode zur Simultanbe- stimmung von T-, B-, 0- und D-Lymphozyten. 3 2. 1 .0 - Methode' 3 2.2.0 - Die altersbezogenen Veranderungen der Normwerte vom Lymphozyten-Klassen beim Menschen. 5 3.0.0 - Die Bestimmung der sauren Phosphatase peripherer Lymphozyten und deren Aktivierbarkeit durch PHA. 6 3.1.0 - Die altersbezogenen Normwerte 6 4.0.0 - Malignes Melanom 7 4.1.0 - Material und Methoden 7 4.2.0 - Absolute und relative Werte der Lymphozyten-Klas- sen bei Melanom-Patienten im Vergleich zur alters- bezogenen Norm. 8 4.2.1 - EinfluB der Therapie auf die Werte der Lymphozyten- Klassen. 9 4.3.0 - Die Aktivitat der sauren Phosphatase peripherer Lymphozyten bei Melanom-Patienten,Effekt von PHA in vitro - Vergleich mit der altersbezo- genen Norm. 9 4.3.1 - EinfluB therapeutischer MaBnahmen auf die Phospha tase-Aktivitat und deren Stimulierbarkeit durch PHA - Kasuistik. 10 5.0.0 - Mamma- und Genitaltumoren der Frau 11 5.1.0 - Material und Methoden 11 5.2.0 - Quantifizierung peripherer Lymphozyten-Klassen re- lativ zur altersbezogenen Norm. 12 5.3.0 - Phosphatase-Werte peripherer Lymphozyten und de- ren Stimulierbarkeit durch PHA bei Tumorpatientin- nen unter Berlicksichtigung des Lebensalters. 13 6.0.0 - Karzinome des Magen-Darm-Trakts 14 6.1.0 - Material und Methoden 14 6.2.0 - Verteilung der Lymphozyten-Klassen im peripheren Blut im Vergleich zur altersbezogenen Norm. 14 6.3.0 - Die Phosphatase-Aktivitat peripherer Lymphozyten und deren Aktivierbarkeit durch PHA unter Berlick- sichtigung des Lebensalters. 15 7.0.0 - Sonstige maligne Tumoren 16 7.1.0 - Material und Methoden 16 7.2.0 Verteilung der Lymphozyten-Klassen im peripheren Blut im Vergleich zur altersbezogenen Norm. 17 7.3.0 - Die Phosphatase-Aktivitat peripherer Lymphozyten und deren Aktivierbarkeit durch PHA unter Berlick- sichtigung des Lebensalters. 17 8.0.0 - Literaturverzeichnis 19 Abbildungen 25 Die Untersuchungen beruhen auf einer Zusamrnenarbeit: Prof.Dr. B. Rauhut/Institut fUr Statistik und Wirtschafts mathematik der RWTH Aachen~ Dr. Falter/Abt. Med. Statistik und Dokumentation der Me.d. Fakultat der RWTH Aachen~ Dr. U. Buschsieweke/Abt. Med. Statistik und Dokumentation der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Dr. W.J. Spolgen/Abt. Med. Mikrobiologie der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Dr. Krause/Abt. Chirurgie der Universitat Maastricht~ Prof.Dr. W. Gahlen/vormals Abt. Dermatologie der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Prof.Dr. W. Meinhof/Abt. Derma tologie der Med. Fakultat der RWTH Aachen; Prof.Dr. Lemrnens/Abt. Chirurgie der Universitat Maastricht~ Prof.Dr. M. Reifferscheid/Abt. Chirurgie der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Prof.Dr. H. Peters/Abt. Chirurgie der Med. Fakul tat der RWTH Aachen~ Prof.Dr. U. Essers/Abt. Innere Medi zin II der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Dr. L. WUst/ Abt. Gynakologie und Geburtshilfe des Marienhospitals Dtiren-Birkesdorf; Dr. K.E. Klepper/Abt. Dermatologie der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Akad.Direktor Dr. K.H. StUrner/Abt. Blutspendedienst der Med. Fakultat der RWTH Aachen~ Frau A. Sticker-Beckers/Abt. Med. Mikrobio logie der Med. Fakultat der RWTH Aachen; Frau I. Barel/ Abt. Med. Mikrobiologie der Med. Fakultat der RWTH Aachen. 2 - 1.0.0 - Vorwort Die Moglichkeit einer tumorspezifischen Immunabwehr (71 u.a.) ist auf zellularer Ebene gegeben durch T-Lymphozyten und hu moral durch IgM-Antikorper, wahrend IgG-Antikorper eher zu einem Enhancement-Phanomen, also zu einer BegUnstigung des Tumorwachstums fUhren (39). FUr eine solche Funktion von T Zellen spricht der "killing"-Effekt fUr Tumorzellen (41, 40, 79, 6, 16, 12, 71, 65) oder Hautreaktionen vom Spattyp (9, 43, 44, 45) nach Injektion von Tumorextrakten. Bei malignem Melanom wurden erniedrigte T-Zellwerte beschrie ben, die sich nach Operation normalisierten (61, 8, 21). Die Frage nach einem prognostischen Wert solcher Erhebungen wurde diskutiert (21). Bei Patientinnen mit Mamma- und Genitaltumoren wurde ebenfalls eine Senkung der Werte beschrieben (77), andererseits aber auch keine diesbezUgliche Veranderung beobachtet (70, 30, 46, 63, 59). Der Nachweis von T-Zellen erfolgte fast immer Uber die "Ro settenbildung" mit Schafserythrozyten (E). Nicht immer wurden dabei sowohl die absoluten (Rosetten/mm3 Blut) und die rela tiven Werte (Rosetten in % der Lymphozyten) erfaBt. FUr den Nachweis von Antikorper-produzierenden B-Lymphozyten stehen verschiedene Methoden zur VerfUgung, wie die Darstel lung von Immunglobulinen (Ig) auf der Oberflache der Zellen durch verschiedene Verfahren (z.B. 36, 19, 28, 47, 58, 80 u.a.), einer Markierung der Fc-Rezeptoren (5, 74, 28, 31, 2, 27 u.a.) und die Darstellung eines C3-Rezeptors (7, 56, 78, 66, 54 u.a.), wobei dieZahl der "C3-Zellen" kleiner als die der "Fc-Zellen" sein soll (22, 37, 53). Lymphozyten mit C3- Rezeptoren werden meist nachgewiesen durch Rosettenbildung mit EAC (E, beladen mit Ambozeptor und C3) oder mit Zymosan-Par tikeln (Z) beladen mit C3b (ZC3b). Als sog. "0- und D-Zellen" werden Lymphozyten bezeichnet, die mit den angegebenen Rosetten-Techniken keine Rosetten oder eine Doppelbeladung (mitE undZC3bgleichzei tig) ergaben. Die erstgenannte Zellart dUrfte trotz einiger Besonderheiten (4, 11, 13, 42) zur Gruppe der B-Zellen (10, 26, 48, 54, 55, 19) zu rechnen seine D-Zellen (20, 29, 37, 64 u.a.) werden unterschiedlich beurteilt, sei es im Sinne einer T- und B-un abhangigen Subpopulation oder von Vorlauferzellen (20). Erstes Ziel der vorliegenden untersuchungen war danach die Entwicklung einer neuen Methode zur Simultanbestimmung von T-, B-, 0- und D-Zellen im peripheren Blut des Menschen und Evaluierung altersabhangiger Veranderungen unter statistischen Gesichtspunkten. Die so gewonnenen altersbezogenen Normwerte sollten dann als BezugsgroBe fUr die Auswertung der entspre chenden Daten bei Tumorpatienten dienen. - 3 - FUr die Reagibilitat von T-Lymphozyten wurde neben der Aus l6sung einer allergischen Hautreaktion vom verz6gerten Typ als Modell oft die Stimulierung durch Phytohamagglutinin (PHA), gemessen an der Transformationsrate, herangezogen. Bei malignem Melanom wurde eine Abnahme der Reagibilitat mit einer NQrmalisierung nach Operation beschrieben (8), z.T. aber auch nur bei Spatstadien (32). Bei malignen gynakologischen Tumoren wies die PHA-Reaktivitat groBe Schwankungen auf (73, 17, 70, 83, 62, 52). GegenUber dies en Transformationsversuchen mit einer Versuehs dauer von 3 - 4 Tagen la8t sieh, wie eigene Versuche zeigten (33),eine PHA-Reaktivitat aueh in Kurzzeitversuehen mit Inku bationszeiten von 1 oder 1 und 4 h dureh Bestimmung der Akti vitat der sauren Phosphatase von Lymphozyten erfassen. Als wei teres Ziel der vorliegenden Arbeit wurde deswegen zu nachst - wie bei der Bestimmung von Lymphozyten-Klassen - die altersabhangige Norm unter statistisehen Gesiehtspunkten untersueht. Diese Werte dienten dann wieder als Bezugsgr68e fUr die bei Tumorpatienten ermittelten Daten. 2.0.0 - Entwieklung einer neuen Methode zur Simultanbestimmung von T-, B-, 0- und D-Lymphozyten. Die Ergebnisse sind publiziert (69, 35, 34), jedoeh seien die wesentlichsten Gesiehtspunkte naehstehend kurz zusammengefa8t. Das Verfahren stellt eine Kombination der Erfassung sog. Spon tanrosetten (E-Rosetten) (75) und der ze3b-Rosetten (54) - beide mit einer gewissen Modifikation der ursprUngliehen An gaben - dar. 2.1.0 - Methode In Vorversuehen wurde eine Reihe von teehnisehen Parametern abgeklart. Zu nennen sind der EinfluB einer Behandlung der E mit Neuraminidase. Es zeigte sieh, da8 eine Konzentration von 0.85 mU/ml keinen Einflu8 auf die Zahl von T-, B-, 0- und D Lymphozyten hat. In weiteren Vorversuehen wurde ein moglicher Einflu8 von Antikoagulantien (z.B. Heparin), der Einflu8 ver schiedener Medien wie fotales Kalberserum (FeS), von Te 199- Medium (Difco), Hank's-Medium (Difco) und von RPMI 1640 (Seromed) untersucht, ferner der EinfluB des pH-Wertes des Reaktionsmediums, der Temperatur und der Inkubationsdauer, sowie die mogliche Bedeutung einer Relation von Lymphozyten zu E. Untersucht wurde ferner ein moglicher EinfluB von Glutaraldehyd, welches zur Vermeidung einer Dissoziation von Rosetten zugegeben wurde, sowie der EinfluB des Materials der Reagenzglaser. Wohl durch Fixieren an die Glasoberflache ist die Zahl der Spontanrosetten (T-Lymphozyten) in Glas kleiner als in Poly styrol-Rohrchen. Die Glutaraldehyd-Behandlung hat in Poly styrol-Rohrehen keinen EinfluB auf die ermittelten Werte, wohl aber bei einem Reaktionsablauf in GlasgefaBen. Letztlich wurde noeh die Moglichkeit eines Einflusses der Spezies als Serum spender fUr Komplement (el untersucht. - 4 - Nach Optimierung des Verfahrens und Kontrolle auf Reproduzier barkeit der Ergebnisse lieB sich folgende Arbeitsvorschrift fUr diese Simultanmethode aufstellen: Je 0.5 ml der zu testenden Lymphozyten-Suspension (4 x 106 Lymphozyten/ml), Neuraminidase-behandelte E (10B/ml) und C3b beladene Zymosan-Partikel (30 mg/l00 ml) werden in Polystyrol Rohrchen gemischt, 15 min bei 370C im Wasserbad erwarmt und anschlieBend 10 min bei 40C gehalten. Zentrifugieren des An satzes bei 200 g (Minifuge, Heraeus-Christ), 60 min Eisbad (OoC) und Resuspension nach VerschlieBen mit Parafilm und vor sichtigem Wenden, bis die Suspension homogen ist (weniger als 1 min zur Vermeidung von Erwarmung und Dissoziation von Spon tanrosetten). Eisbad und Zugabe von 5 ml vorgekUhlter (4°C) 0.75 %oigen Glutardialdehyd-Losung, nach 10 min erneut mischen. Je 3 ml davon werden im 4-fachen Ansatz auf Objekt trager zentrifugiert (7 min bei 55 g mit Cytospin) (Fa. Shandon, Elliot, Camberley GB), wodurch ein einschichtiger Zellnieder schlag auf eine Kreisflache mit einem Durchmesser von 5 rom aufgebracht wird. Farbungen: a) Peroxydase-Farbung zur Markierung von Granulozyten und Monozyten (zur Vermeidung von Auswertfehlern) ; b) PAS-Farbung der Zymosan-Partikel und c) Gegenfarbung mit Mayer's Hamalaun (Lymphozyten-Kerne). Bewertung: Als Spontanrosetten (T-Lymphozyten) werden Zellen mit min destens 3 angelagerten E gewertet; als B-Zellen mit C3b Rezeptoren solche Lymphozyten mit mindestens 3 angelagerten ZC3b-Partikeln, als O-Zellen solche Lymphozyten mit weniger als je 3 angelagerten E resp. ZC3b-Partikel und als D-Zellen solche Lymphozyten die mindestens je 3 E und gleichzeitig ZC3b-Partikel angelagert hatten. Technische Anmerkungen: a) Neuraminidase-Behandlung der E zur Stabilisierung der E-Rosetten. 7 ml E (109/ml) in TC 199-Medium (Difco) + 1 ml Neura minidase-Losung (6 mU/ml) - 1 h bei 370C im Wasserbad - 3 x waschen in "Hank's balanced salt solution", pH 7,2 (Zentrifugieren stets bei 200 g, 10 min, 40C). Die E-Sus pension soIl nie alter als 5 Tage bei einer Aufbewahrung bei 40C sein. b) Beladung von Zymosan-Partikel mit C3b (siehe 54). 3 mg Zymosan (Carl Roth/Karlsruhe) + 10 ml TC 199-Medium, Suspension aufnehmen mit einer dicken Kantile und Plastik spritze und dann ausspritzen tiber eine enge Kantile (Ka ntile 18) (3 x ~iederholen zwecks guter Verteilung der Sus pension), zu gleichen Volumina Zugabe von Humanserum (AB, Rh) als C-Quelle, 1:20 verdtinnt in gepufferter Hank's-Lo sung von pH 7,2 (Aktivierung von C bis C3b), 3 x was chen - 5 - in TC 199-Medium (10 min bei 200 9 und 40C), Resuspension der beladenen Zymosan-Partikel in frischem TC 199-Medium (10 ml = Ausgangsvolumen der Zymosan-Suspension) und homo gen verteilen. c) Isolierung der peripheren Lymphozyten. A Zugabe von Portionen 10 ml heparinisierten Vollblutes in sterile, nicht silikonisierte K5lbchen mit je 300 mg ste rilem Carbonyl-Eisenpulver und einigen sterilen Glasperlen mit einem Durchmesser von 1 mm: 10 min Inkubation bei 370C im Wasserbad unter vorsichtigem SchUtteln (so schnellere Sedimentation von Phagozyten). Zugabe der Mischung in Por tionen von 10 ml in Polystyrol-R5hrchen (Fa. Sarstedt) mit 2 ml steriler 5 %iger Dextranl5sung, Inkubation Uber 30 min bei 370C. Der lymphozytenreiche Uberstand wird abgenommen und in Portionen zu je 1.5 ml Uber 1.0 ml Ficoll-Isopaque L5sung in sterilen Glasrohrchen gegeben. So fort zentrifu gieren bei Zimmertemperatur (15 min, 1.000 9 in Sorvall Zentrifuge GLC-1). Die in der Zwischenschicht vorhandenen Lymphozyten werden mit Pasteur-Pipetten aus jeweils 4 Rohr chen zusammen in 10 ml TC 199-Medium gegeben und 30 min bei 40C und 200 9 zentrifugiert (Minifuge, Heraeus-Christ): das erhaltene Sediment wird 1 x gewaschen und die Zellen in 5 ml TC 199-Medium gegeben und die Zelldichte durch Aus zahlen bestimmt. VitalitatsprUfung der Zellen mit 5 %iger Eosinl5sung in phys. NaCI-L5sung (Farbexklusionstest). Kontrolle auf die Anwesenheit von "Nicht-Lymphozyten" und Emit der Pappenheim-Farbung bei insgesamt 300 ausgezahl ten Zellen. 2.2.0 - Die altersabhangigen Veranderungen der Normwerte von LYmphozyten-Klassen beim Menschen. Ergebnisse: a) Die absoluten Lymp'hozyten-werte im Blut nehmen altersab hangig abo b) Die absoluten Werte fUr T-, B-, 0- und D-Zellen zeigen ei ne statistisch signifikante Abnahme mit zunehmendem Alter. Die statistische Berechnung erfolgte mit der rank correlation-Methode nach Spearman. c) Die relativen Werte dieser Lymphozyten-Klassen, ausgedrUckt in % verandern sich Uber das untersuchte Altersspektrum zwischen 19 und 80 Jahren nicht. AIle Werte bewegen sich innerhalb der Vertrauensgrenze. d) Ein Unterschied zwischen Mannern und Frauen besteht Uber den ganzen Altersbereich nicht. e) Bei der Bewertung der Daten von Patienten ist, unter Heran ziehung der absoluten Werte, ein Vergleich mit der jeweils altersbezogenen Norm erforderlich. Besprechung der Ergebnisse: Die Beobachtung einer altersbe zogenen Abnahme der absoluten Gesamt-Lymphozytenwerte im Blut stimmt mit anderen Autoren Uberein (13, 23, 24, 28, 67). - 6 - Die mit der vorgestellten Simultanmethode ermittelte Abnahme der absoluten Werte fUr T-Lymphozyten mit zunehmendem Alter entspricht den mit anderen Verfahren ermittelten Befunden (24, 42). Die Angaben tiber den relativen Anteil von T- und B-Lympho zyten sind in der Literatur nicht ganz einheitlich. Folgendes kann aber gesagt werden: Unsere mit der Simultanmethode be stimmte Konstanz der relativen Werte stimmt mit einigen Anga ben in der Literatur Uberein (24, 67, 76, 82), andere Autoren (14, 38) beschreiben dagegen eine altersab~ngige Minderung der relativen T-Werte. Eine Analyse zeigt aber, daB in den letztgenannten Untersuchungen auch Probanden unter 20 Jahre einbezogen waren, die bei uns fehlten. Vergleicht man jedoch die relativen T-Zellwerte bei Patienten zwischen 20 und 50 Jahren (14), dann ergibt sich ebenfalls eine Konstanz ent sprechend den hier mitgeteilten Befunden. Unter denselben Ge sichtspunkten stimmt auch die mit der Simultanmethode ermit telte altersunabhangige Konstanz der relativen B-Zellwerte mit Angaben anderer Autoren (und anderer Methoden) (76, 72) - von einer Ausnahme abgesehen (24) - Uberein. 3.0.0 - Die Bestimmung der sauren Phosphatase peripherer LYmphozyten und deren Aktivierbarkeit durch PHA. Das Prinzip des Verfahrens wurde von uns frtiher beschrieben (33). Es beruht auf dem Nachweis von p-Nitrophenol (NP), das bei pH 5,6 aus p-Nitrophenylphosphat freigesetzt wird. Ftir aIle hier mitgeteilten Untersuchungen wurde stets die gleiche Versuchsanordnung benutzt. Im einzelnen sei folgen- des erwahnt: 5 Isolierung peripherer Lymphozyten siehe oben (2.1.0): 2 x 10 Lymphozyten/ml: Medium = TC 199: stets 4-fache Ansatze: die Versuchsansatze enthielten 50 ~g PHA-P/ml (Difco): Inkubations zeit = 1 h, 370C (die Werte nach einer Inkubation von 4 h sind hier nicht aufgeftihrt): Fermentreaktion bei pH 5,6 (Michaelis Puffer) und Farbentwicklung bei pH 12,0, photometrische Be stimmung bei 405 nm in 20 mm Ktivetten. K = Kontroll- oder Basiswert (ohne PHA) V = Versuch (mit PHA) Puffer/Substrat-Kontrolle = ohne Zellen. Die Werte werden angegeben in ~g NP (bei stets gleicher Zell zahl), Stimulierbarkei t = V - K in ~g NP (/).), Stimulierbar keit % = 100(V - K) /K (/). %): in diesem Fall handelt es sich um eine Normalverteilung: deswegen Berechnung nach dem Pearson Korrelations-Koeffizienten (sh. 34). 3.1.0 - Die altersbezogenen Normwerte. Die Ergebnisse wurden publiziert (34, 35, 69), dennoch seien die Resultate summarisch wiedergegeben. a) Sowohl die K- als auch die V-Werte zeigen eine Abnahme mit zunehmendem Alter. Dies ist statistisch signifikant. Die V-Werte nehmen aber altersbezogen weniger schnell ab als die K-Werte. Daraus resultiert mit zunehmendem Alter eine Zunahme von /). ~g NP.