FORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN Herausgegeben im Auftrage des Ministerpräsidenten Dr. Franz Meyers von Staatssekretär Professor Dr. h. c. Dr. E. h. Leo Brandt Nr.1029 Dr. Hans Füsser cand. rer. not. Egon Flach Prof. Dr. Hermann Fink Institut für Gärungswissensdtaft und Enzymchemie der Universität Köln Versuche zur gleichzeitigen Gewinnung von Hefeeiweiß und Antibiotika Als Manuskript gedruckt WESTDEUTSCHER VERLAG I KOLN UND OPLADEN 1962 ISBN 978-3-663-03888-7 ISBN 978-3-663-05077-3 (eBook) DOI 10.1007/978-3-663-05077-3 G 1 i e der u n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. Einleitung s. 5 s. 2. Hauptteil 7 a) Vorversuche • s. 7 b) Hefezüchtungen im Belüftet-Bottichverfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von Hefeeiweiß und Kulturfiltrat •••••••••• s. 15 c) Versuche zur Gewinnung von Mutanten • s. 34 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. Zusammenfassung s. 4. Literaturverzeichnis s. Sei te 3 1. Einleitung Ein groBer Teil der Bakterien, der Aktinomyceten und der Schimmelpilze sind im Laufe der Zeit auf Bildung von antibiotisch wirksamen Stoffen untersucht worden. Über Substanzen mit antibiotischem Charakter bei He fen ist im allgemeinen wenig bekannt. LEDERMANN und KLOPSTOCK konnten 1903 beobachten, daß Typhusbazillen, Staphylokokken und Colibakterien durch gärende Preßhefen und andere Hefen abgetötet wurden. FERNBACH und Mitarbeiter haben 1909 aus Hefen einen Stoff gewonnen, der gegen andere Hefen und Bakterien aktiv war. Bakteriolytische Wirkung von Hefen auf Typhus-, Paratyphus- und Desente rie-Bazillen beschrieb 1924 SCHILLER. Die Hefen wurden zu erzwungenen Antagonisten der Bakterien, die als einzige Stickstoffquelle die stick stoffhaItigen Substanzen der Bakterien benutzten. Auch Tuberkelbazillen wurden nach SCHILLER angegriffen. Die bakteriolytische Substanz soll von den Hefen ausgeschieden werden und auch außerhalb der Zelle wirksam sein. P.L. CARBONIERI (1926) berichtete über die Wirkung von Saccharomy ces bulgaricus, die darin bestand, daß der Keimgehalt der Zelle redu ziert wurde, nachdem die Hefe per os verabreicht worden war. Nach OKUMUKI (1931) bildet Torula suganii eine gegen Pilze wirksame Substanz, die sich nur in der Zelle findet und sich in Aceton, Alkohol, Äther und Chloroform löst. SPARAPANI (1931) konnte beobachten, daß in Filtraten von Saccharomyces Sardus Colibakterien, Typhus- und Paratyphusbazillen, Streptococcus mastidis nach 96 bis 135 Stunden bei 37°C aufgelöst wur den und anschließend nicht mehr zur Entwicklung kamen. BARGLOWSKI be richtete 1938, daß filtrierte Kulturflüssigkeiten von Saccharomyces cerevisiae und Mycotorula albicans, die den Nährböden zugefügt wurden, das Wachstum von Tuberkelbazillen hemmten. COOK, GREKE, GIERSCH und SCHROEDER (1941) sprechen von wachstumshemmender Substanz aus Hefen auf die Pilze Aspergillus niger und Penicillium glabrum. Diese Substanz wurde durch fraktionierte Fällung eines konzentrierten Alkohol-Hefe Extraktes gewonnen. TAKAHASHI (1942) konnte aus autoklavierter Bäcker und Bierhefe nach Extraktion mit Alkohol, Safranin und neutralem Blei acetat einen Inaktivator für Tabakmosaikviren gewinnen. Nach CARPENTER (1945) hemmt Torulopsis utilis var. thermophila und Torulopsis utilis var. major das Wachstum von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli auf festen Nährböden in vitro. Richard KOCH und Mitarbeiter berichteten 1952 über antibiotische Wirkungen von Hefen auf Bakterien. Seite 5 In neuerer Zeit liegen u.a. Arbeiten von PARVENTJEV (1954) über anti biotisch wirksame Substanzen aus Bäckerhefen vor, die in einigen Fällen aktiv gegen gramnegative Bakterien sind. Nach NAY (1954) sollen auch Bierhefen antibiotisch wirksame Stoffe produzieren, die die Hefen gegen bestimmte Mikroorganismen-Infektionen schützen. Aus der Praxis ist weiter bekannt, daß gärende Hefen wie Bier-, Bäcker hefen und Weinhefen einen großen Teil der gelegentlich vorkommenden Mikroorganismen durch ihre Stoffwechseltätigkeit unterdrücken oder in ihrem Wachstum hemmen können. Alkohol- und Kohlensäurebildung, veränder te pH-Werte, Verschiebung des Redox-Potentials, Wuchs- und Nährstoff entzug können die Hemmung mit beeinflussen. Bei der Züchtung der Wuchs hefe Torula utilis (nach LODDER Torulopsis utilis) im Belüftet-Bottich verfahren haben FINK und Mitarbeiter 1935 erstmals beobachtet, daß in der Dauerzüchtung über viele Passagen keinerlei Infektionen festzustel len waren, wobei allerdings nur Ammoniak-Stickstoff als einzige Stick stoffquelle und Holzzuckerlösungen bzw. ·Sulfitablaugen als Kohlenstoff quelle verwendet wurden. Die anfängliche Erklärung, daß die Ursache dieses Phänomens in gewissen Hemmstoffen des Holzzuckers bzw. der Sulfitablaugen zu suchen sei, an die sich die verwendete Torula-Hefe anpasse, dagegen aber die Infektions flora nicht, wurde später fallen gelassen. 1944 konnten FINK und Mitar beiter beobachten, daß bei der aeroben Züchtung von Torula-Hefen in reinen Zuckerlösungen Stoffe mit hemmender Wirkung in der Züchtungs flüssigkeit nachgewiesen wurden. Arbeiten über die Verwendung von Kulturfiltraten aus der Torulazüchtung - als Parallele zur Penicillingewinnung - sind sonst nicht bekannt. Aus der Literatur geht lediglich hervor, daß die Autoren entweder die Hefen selbst oder Hefeextrakte auf antibiotisch wirksame Substanzen unter sucht haben. Es erschien daher interessant, in Fortführung und Erweiterung der oben genannten Beobachtungen die bei der mikrobiellen Eiweißsynthese viel fach verwandte Wuchshefe Torulopsis utilis auf ihre Fähigkeit, anti biotische Stoffe zu bilden, zu untersuchen. Diese Hefe wird technisch im Belüftungsverfahren vermehrt, so daß bei Bildung wirksamer Stoffe es leicht möglich wäre, gleichzeitig Hefeeiweiß und aus dem Substrat diese wirksame Substanz zu gewinnen. Seite 6 2. Hauptteil a) Vorversuche In orientierenden Versuchsreihen wurden zunächst Hefen vom Typ Torulop sis utilis verschiedener Herkunft untersucht. Später wurden weitere Hefen geprüft und getestet. Die Testungen wurden auf einem von uns ent wickelten Standard-Nährboden, der folgende Zusammensetzung hatte, durch % % geführt: Ein Prozent Glukose, 0,1 K2HP04, 2 Agar und Hefewasser. In den späteren Versuchsreihen wurde der Nährboden durch Zugabe von 1 % Standard I von Merck weiter ergänzt. Die Testungen erfolgten in Form von Hefestrichtesten gegen Bakterien, und zwar in ähnlicher Weise wie in den Versuchen von A.M. SKORODUMOWA mit Saccharomyces cerevisiae - Arten beschrieben. Die Methode ähnelt im Prinzip der Oxford-Zylindertest-Methode, wonach je 1 ccm einer 24 Stunden alten Bakterienkultur in ca. 0,5 %igen Glukose-Agar obiger Zu sammensetzung eingeimpft wird. Diese Platten wurden ca. 2 Stunden bei Zimmertemperatur zum Erstarren aufgestellt und anschließend Hefestrich kulturen angelegt. Bei den Hefen handelte es sich stets um junge 24 bis 48 Stunden alte Kulturen. Als Testorganismen dienten außer Staphylococcus aureus L 2 aV "Bram" Berlin-Lichterfelde und Mycobakterium phlei Syn. Mycobakterium moel·leri vor allem Sarcina lutea 2 BA und Staphylococcus roseus. Folgende Hefen wurden in den ersten Versuchsreihen getestet: Torula pseudomycel A Torula utilis S Torula utilis 1 W Torula utilis 2 W Torula utilis K (mit kleinen runden Zellen von unterschiedlicher Größe) Torula utilis A Torula utilis B Stamm 8 Von den sieben Stämmen Torulopsis utilis zeigten nur sechs mehr oder weniger starke Hemmwirkung. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die Hefen (Hefe strich = 1 mm) Hemmzonen im Verhältnis 1 1,1 bis 1 : 5,5 gebildet haben. Einige von diesen Hefen wurden in späteren Versuchen zum Teil unter Mitarbeit von E. FLACH gezüchtet und weiter untersucht. Seite 7 Tab e 1 1 e 1 Das Verhältnis der Hefen zu den Hemmzonen in mm nach 48 stunden Nr. H e f e n Staphylococcus Sarcina lutea roseus 183 Torula pseudomycel 8 I 9 ( 1 I 1 , 1 ) 1 : 15 ( 1 ·· 2,1 ) 184 Torula utilis S. 8 : 16 ( 1 : 2 ) 4 : 22 (1 ·· 5,5) .. 161 Torula utilis 1W 8 9 ( 1 : 1 , 1 ) .. 162 Torula utilis 2W 10 : 12 (1 1 ,2) 163 Torula utilis K 5 : 15 (1 : 3 ) 4 : 22 (1 ·· 5,5) 186 Torula utilis A 1 : 8 ( 1 : 1 ,1) --- 188 Torula utilis B Andere Torula-Hefen wurden im Plattenstrichtest gegen Sarcina lutea und Staphylococcus roseus geprüft. Die untersuchten Hefen zeigten keine Hemmwirkung und wurden daher nicht weiter verwertet. Es handelte sich u.a. um folgende Hefen: Torula casei 2, Torula M.N. (Nürnberg), Torula F. (FLEISCHMANN), Torulopsis kefir, Torulopsis pulcherrima (Geisenheim), Rosa Torula (Kiel), Candida spec. (Kiel), Candida tropicalis (Geisen heim), Candida lipolytica Nr. 8662 (Prof. ROSELL), Candida pseudotropi calis Nr. 2512 (Prof. ROSELL), Torula nigra (Aschaffenburg), Torula utilis var. coll., Torula pulcherrima (Aschaffenburg) und Torulopsis utilis var. thermophila Nr. 9255. Zu den Strichtesten wurden nicht nur Torula-Hefen, sondern auch andere Hefearten herangezogen. Bei diesen Versuchen konnte beobachtet werden, daß außer Torulopsis utilis auch andere Hefen hemmende Wirkung besonders gegen Sarcina lutea aufweisen. Auch hier konnten zum Teil Hemmzonen im Verhältnis von 1 : 2 bis 1 : 5 gemessen werden. Es wurden folgende Hefen getestet: Brettanomyces spec. (Leverkusen) Saccharomyces fragilis Typ E 8635 (Prof. ROSELL) Saccharomyces lactis (Kiel) Willia anomala IV (Geisenheim) Saccharomycodes spec. (Geisenheim) Saccharomycodes Ludwigii (Geisenheim) Schizosaccharomyces pombe Lindner (Aschaffenburg) Sporobolomyces holsaticus (WINDISCH) Saccharomyces Logos (van LAER et DENAMUR) und Nadsonia elongata. Seite 8 Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß von den 10 untersuchten Hefen nur zwei Hefen keine Hemm wirkung zeigten. Ein Teil dieser Hefen, so u.a. Brettanomyces spec., Saccharomycodes und Schizosaccharomyces, wurde später im Rahmen einer weiteren Arbeit im Belüftet-Bottich-Verfahren gezüchtet und die Kulturfiltrate getestet. Tab eIl e 2 Das Verhältnis der Hefen zu den Hemmzonen in mm nach 24 Stunden H e f e n Sarcina lutea Brettanomyces spec. 4 ·· 17 ( 1 ·· 4,25) Saccharomyces fragilis -- Saccharomyces lactis -- · Willia anomala 4 · 8 ( 1 : 2 ) Saccharomycodes spec. 4 ·· 20 ( 1 ·· 5 ) Saccharomycodes Ludwigii 4 ·· 16 ( 1 ·· 4 ) Schizosaccharomyces pombe 4 ·· 17 ( 1 ·· 4,25) Sporobolomyces holsaticus 4 ·· 6 ( 1 ·· 1 ,5 ) Saccharomyces Logos 3 ·· 7 ( 1 ·· 2,33) Nadsonia elongata 5 : 10 ( 1 ·· 2 ) In den Abbildungen 1 bis 6 wurden die Hemmzonen einzelner Hefen gegen verschiedene Bakterien festgehalten. Die deutliche Hemmwirkung von Torula utilis K (163) gegen Sarcina lutea, Staphylococcus aureus (1 : 3 mm) und Myco~akterium phlei (1 : 2 mm) ist zu erkennen. Dagegen treten die z.T. geringen Hemmzonen der anderen Torula-Hefen nicht sehr deutlich hervor. Auch die bei Torula utilis Stamm 161 gemessenen Hemm höfe gegen Sarcina lutea und Staphylococcus roseus sind nur schwach sichtbar. Aus den Abbildungen 2 und 3 geht weiter hervor, daß die Toru la-Hefe Stamm 163 erst nach 48stündigem Wachstum sehr starke Hemmwir kung gegen Staphylococcus aureus erkennen ließ. Ähnlich liegen die Verhältnisse beim Test gegen Mycobakterium phlei (Abb. 4). Im Gegensatz zu den vorhergehenden Testen ist auch hier bei der Torula-Hefe Stamm 161 eine deutlichere Hemmung gegen Mykobakterium phlei zu verzeichnen. Die beiden Stämme Torula utilis 161 und Torula utilis 163 wurden für die späteren Züchtungen ausgewählt. Seite 9 s i u e e hl r u p a m s u u i c r 2 c e o 4 kt c a g lo en g ob y d c n h n n y u ap tu u M 2 d St S 2 d i 4 e 1 i 2 1 b e b i g b ach b i ung n n d b u b il A Bild A n-B e n- n e o n z o m z m m e m H e H s u 1 e 6 a r 1 e u t a m u m l us ta a c S 1 in 3 oc 2 c c r o g a g l , S y 3 n i n ph 16 du be du Sta m m 1 ung 2 1 ei Sta b b i n-Bild b b i ung b 1 n. A ne A ld de o Bi n mz n- tu m e S n e o 8 H z 4 m m h c e a H n tIl 111 .... c+ (!) o A b b i 1 dun g 5 Hemmzonen-Bildung bei Sarcina lutea 1 Brettano~yces spec. J 2 A b b i 1 dun g 6 Hemmzonenbildung bei Sarcina lutea 1 Schizosaccharomyces pombe 3 Saccharomycodes Ludwigii 2 Saccharomycodes spec. 4 Saccharomyces logos. Auch bei den Hefen der Tabelle 2 konnten Hemmwirkungen besonders gegen Sarcina lutea festgestellt werden. Die Abbildung 5 enthält einen Brettanomyces-Stamm, und in der Abbildung 6 sind die Hefen Saccharomy codes spec., Saccharomycodes Ludwigii sowie Schizosaccharomyces pombe und Saccharomyces logos wiedergegeben. Diese Hefen wurden aber im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Seite 11