Chlamydia szaporodás vizsgálatára alkalmas, új módszer kifejlesztése és használata anti- és pro-chlamydiális anyagok hatásának vizsgálatára A Ph.D. értekezés tézisei Varga-Bogdanov Anita M.Sc. Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Intézet Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Szegedi Tudományegyetem Témavezetők: Professzor Dr. Deák Judit Ph.D. Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Intézet Szegedi Tudományegyetem Dr. Virók Dezső Ph.D. Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Szegedi Tudományegyetem Szeged 2017 2 1 Bevezetés A szexuálisan terjedő fertőzések (STI) a leggyakoribb fertőző betegségek a világon. Az STI-k között a Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) eredetű fertőzések a legelterjedtebbek. A C. trachomatis D-K szerovariánsai okozhatnak, mint az urethritis, cervicitis, kismedencei gyulladást (PID) és meddőséget, míg az LGV szerovariánsok a lymphogranuloma venereum, egy szisztémás manifesztációval rendelkező STI kórokozói. A C. trachomatis-t összefüggésbe hozzák az arthritis-szel és a spondyloarthritis-szel is. Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) gyakori oka a közösségben szerezhető tüdőgyulladásnak, és feltételezhetően bizonyos krónikus megbetegedések okozója is lehet, mint például az asthma vagy az érelmeszesedés. A humán herpes simplex vírus 1 (HHSV-1) és a HHSV-2 gyakori virális okozója a genitális fertőzéseknek. A HHSV-2 szeropozitív emberek (15-49 év) száma 2012-ben megközelítőleg 417 millióra tehető, a populációban 11,3% gyakorisággal fordul elő. Az urogenitális és anális régió típusos léziói mellett, a HSV fertőzések kiváltó okai lehetnek az encephalitis-nek, meningitis-nek és a neonatális herpes fertőzéseknek. A C. trachomatis és a HHSV-2 patogének sokszor perzisztens vagy látens fertőzést is okozhatnak a kórokozó belépési helyén (C. trachomatis) és/vagy a primer fertőzéstől távolabb, például a keresztcsonti ganglionban a HHSV-2, míg C. trachomatis esetében az ízületekben. A chlamydia zárványok számolására az immunfluoreszcens festést követő manuális számolás az általános metodika, mellyel a chlamydia ellenes antibiotikumok és egyéb szerek pozitív vagy negatív hatásának vizsgálatára. A titán-dioxid (TiO ) a titán természetesen előforduló oxidált formája, három 2 leggyakoribb formája a rutile, az anatase és a brookite. A TiO anatase formája UV fény 2 hatására fotokatalitikus hatással bír, mely során a vizet erős oxidatív potenciállal rendelkező hidroxil gyökökre bontja. A TiO nanorészecskék erős antibakteriális hatással rendelkeznek. 2 A TiO a fotokatalízis során reakcióba lép a vízzel, hogy a hidroxil gyököket a superoxid 2 következő formájára bontsa. A DNS károsodását tudja előidézni ezzel pusztítva el a baktériumot. A TiO nanorészecskéket élelmiszer adalékanyagként illetve gyógyszerek 2 hordozóanyagaként használják. Ezen ismeretek alapján szeretnénk a TiO hatását vizsgálni C. 2 trachomatis és HHSV-2 kórokozókkal szemben, nem aktivált formában. 2 Célkitűzések - Automatizált rendszer kifejlesztése chlamydia zárványok detektálására és számolására. - Új vegyületek és nanoanyagok hatásának vizsgálata C. trachomatis és HSV-2 fertőzésekkel szemben. 3 Anyagok és módszerek 3.1 Sejtvonalak HeLa 229 (ATCC), McCoy (ATCC) és Vero (ATCC) sejtvonalakat használtunk kutatásaink során. Az említett sejteket 96 mélyedést tartalmazó lemezeken (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) és 16 mélyedést tartalmazó szövettenyésztő tárgylemezen (chamber slide rendszeren) (Thermo Scientific™ Nunc™ Lab-Tek™,Waltham, MA, USA) szaporítottuk. 3.2 Chlamydia törzsek Kísérleteink során két Chlamydia fajt használtunk: C. trachomatis (D szerovariáns, UW3/CX referencia törzs és L2 szerovariáns, VR-577 törzs; ATCC) és C. pneumoniae 3 (CWL029). A Chlamydia baktériumtörzseket egy korábban leírt metodika szerint szaporítottuk és részlegesen tisztítottuk. 3.3 Humán herpesz szimplex vírus Humán herpesz szimplex vírus 2 (HHSV) referencia törzset (Országos Közegészségügyi Intézet Budapest) használtuk a későbbi kísérleteinkben. A HHSV-2 törzset Vero sejten szaporítottuk. 3.4 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid (MTT) teszt A nanoanyagok toxikológiai profilját az általánosan használt MTT teszt segítségével határoztuk meg. Az MTT teszt során a használt anyagok maximális nem toxikus szintjét HeLa és Vero sejteken vizsgáltuk. 3.5 Ezüst nanorészecskék preparálása Redukáló és stabilizáló szerként nátrium-borohidridet és nátrium citrátot használtunk minden esetben. A preparált ezüst nanorészecskék vizes diszperziójának kiindulási koncentrációja 100 ppm volt (0,92mM), a részecskék átlag mérete a transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálat szerint 20,2± 8.34 nm-nek bizonyult. 3.6 Ezüsttel módosított TiO nanorészecskék preparálása 2 Öt gramm titán-dioxidot (P25, Degussa-Evonik) 100 ml bidesztillált vízben diszpergáltunk, majd erőteljes keverés közben 40 ml ezüst-nitrát (57,9·10−3 mM; Reanal) oldatot adagoltunk a szuszpenzióhoz. A pH-t 7,2-re állítottuk be, majd a szuszpenzióhoz csepegtetve 60 ml Na-borohidridet adagoltunk, bidesztillált vízzel mostuk, centrifugáltuk és szárítottuk. 3.7 A TiO és Ag-TiO részecskék elektronmikroszkópos vizsgálata 2 2 A szintetizált Ag-, TiO - és Ag-TiO nanorészecskék morfológiáját és részecskeméretét 2 2 TEM-el vizsgáltuk. A TEM vizsgálatokhoz a mintákat a rézzel bevont érdes szénfilm mintatartóra (200 Mesh) cseppentés előtt desztillált vízben ultrahangoztuk. 3.8 TiO , Ag és TiO -Ag nanorészecskék töltésmennyiség meghatározása 2 2 A töltéstitrálásos mérések során a vizsgált rendszer áramlási potenciálját mértük, miközben az ezüst-, TiO - és Ag-TiO szuszpenziókat ellentétes töltésű (hexadecilpiridinium- 2 2 klorid; HDPCl) tenzid oldattal titráltuk. A méréseket háromszor ismételtük meg. 3.9 Nanoanyagok Chlamydia trachomatis szaporodásra gyakorolt hatásának vizsgálata HeLa sejten A vizsgálat során a HeLa 229 (ATCC) sejteket 96 mélyedést tartalmazó lemezeken szaporítottuk 6x104 sejtszámmal MEM tápfolyadékban. A TiO , Ag és TiO -Ag nanorészecskéket fiziológiás sóoldatba oldottuk be, majd 2 2 szukróz foszfát glutamin (SPG) pufferben hígítottuk tovább. A C. trachomatis elementáris testeket a nanorészecskékkel együtt 1 órán keresztül, 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubálást fénytől elzárva végeztük, az esetleges fotokatalízis elkerülése érdekében. A TiO és TiO -Ag 2 2 nanorészecskék esetében 100-0,024 µg/ml, míg az Ag nanorészecskék esetében 0,5-0,001 µg/ml koncertráció tartományt vizsgáltunk. Mind a két esetben 1:4 léptékű hígítást végeztünk. A lemezen felnőtt sejteket a kezelt és kezeletlen C. trachomatis-szal (MOI 8) egy órán keresztül, 37 °C-on inkubáltuk 5%-os CO jelenlétében. A fertőzést követően a sejteket 2 4 két alkalommal mostuk foszfátpufferes sóoldattal (PBS), 200 µl/lyuk mennyiséggel. A mosást követően cikloheximiddel (1µg/ml) kiegészített tápfolyadékot adtuk a sejtekhez és 37 °C-on, 5% CO jelenlétében 48 órán keresztül inkubáltuk. 2 3.10 Nanoanyagok HSV-2 szaporodására gyakorolt hatásának vizsgálata Vero sejten A Vero sejteket (ATCC) 96 mélyedést tartalmazó lemezen szaporítottuk, 6x104 sejtszámmal Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) tápfolyadékban (Sigma, USA), mely a következőket tartalmazta: 5% magzati borjú szérum (FBS) (Gibco, Németország), 0,14% nátrium bikarbonát, 100 egység/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin szulfát és 250 µg/ml amphotericin B. Az előinkubációt és a fertőzést a korábban leírtak szerint végeztük. A HHSV-2-vel (MOI 0,1) fertőzött sejteket kétszer mostuk PBS-sel a fertőzést követően, majd a lemezeket 12 órán át inkubáltuk 37 °C-on, 5% CO jelenlétében. 2 3.11 C. trachomatis és HHSV-2 szaporodásának vizsgálata direkt kvantitatív PCR segítségével (qPCR) A sejtek felülúszóját eltávolítottuk, majd a sejteket PBS-sel mostuk. A második mosás után 100 µl Milli-Q (MQ) vizet (Millipore, Billerica, MA, USA) adtunk a sejtekhez, majd a sejtfeltárást két egymást követő fagyasztás (-80 °C, 15 min) olvasztás (szobahőmérsékleten) ciklussal oldottuk meg. A felolvasztott sejtlizátumot alaposan összekevertük egy többcsatornás pipetta segítségével, majd ezt a lizátumot használtuk mintaként a kvantitatív PCR során. A qPCR-t Bio-Rad CFX96 valós idejű készülékkel végeztük el. A reakcióhoz az SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) PCR mixet és C. trachomatis pykF génspecifikus primerpárt használtunk. A primer szekvenciája a következő: pykF-F:5′-GTTGCCAACGCCATTTACGATGGA-3′, pykF-R:5′-TGCATGTACAGGATGGGCTCCTAA-3′. A PCR negyven 20 másodperces, 95 °C-os és 1 perces 64 °C-os ciklusokból állt, míg a polimeráz aktivációs lépése 10 percen keresztül 95 °C-on történt. Az olvadáspont analízist használtuk az amplifikáció specifitásának bizonyítására. Mindegyik PCR esetében, a ciklus küszöbértéket/ciklusszámot (Ct) használtuk eredményeink kiértékelésére, mely azonos azzal a ponttal ahol az amplifikációs görbe metszi az alapvonalat. A HSV-2 fertőzött sejtek esetében a kiértékelésre ugyanazt a qPCR metodikát használtuk, mint a C. trachomatis-szal fertőzött sejtek esetében, a HSV-2 vírusra specifikus primerpárral, melynek a szekvenciája a következő: gD2-F:5′TCAGCGAGGATAACCTGGGA-3′, gD2-R:5′-GGGAGAGCGTACTTGCAGGA-3′. A minták közötti statisztikai különbséget Student’s t-test segítségével határoztuk meg (3 biológiai ismétlést készítettünk minden vizsgált esetében). 3.12 Chlamydia szaporítása 16 mélyedést tartalmazó tárgylemezen Ebben a kísérletben a HeLa sejtek szaporítására 16 mélyedéssel rendelkező, speciálisan felületkezelt tárgylemezeket (chamber slide) használtunk. Irodalom A C.trachomatis D szerovariánssal végzett fertőzés esetén a lemezt 200 µl/lyuk mennyiségű HBSS-sel mostuk, majd szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk 1% DEAE-dextránnal (80 µl/mélyedés). A DEAE-dextrán eltávolítását követően a sejteket megfertőztük 1 IFU/sejt multiplicitással a teljes lemezen vagy kettes léptékben hígított C. trachomatissal 1 IFU/sejt kiindulási koncentrációval. C. trachomatis L2 szerovariáns esetében 1 - 1:64 IFU/sejt míg a C. pneumoniae-val történt fertőzés esetén 1:8 - 1:512 IFU/sejt közötti multiplicitással fertőztük a 5 sejteket. A lemezeket a fertőzést követően 37 °C-on, 5% CO jelenlétében 24 vagy 48 órán 2 keresztül inkubáltuk, majd a sejteket fixáltuk és immunfluoreszcens módszerrel festettük. 3.13 Chlamydia fertőzés gátlása antibiotikumokkal és IFN- γ-val A kísérletek során a tetraciklint és a moxifoxacint teszteltünk az antibiotikumok közül. A tetraciklin esetén 0,25-0,004 µg/ml, míg a moxifloxacin esetében 0,04-0,0006 µg/ml koncentráció tartományban teszteltük az antibiotikumok hatását. Az ismert antibiotikumok mellett egy ismeretlen anyagot is teszteltünk. A PCC00213 (10 mg/ml) számú antibakteriális hatással rendelkező anyagot dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk fel és 10-0,156 mg/ml koncentráció tartományban teszteltük. A fertőzést követően (McCoy sejtek, C. trachomatis D (MOI 1)) cikloheximiddel kiegészített tápfolyadékban az említett antibakteriális anyagokat hígítottuk (1:2 léptékben) és a sejtekhez adtuk, két párhuzamos mélyedést kezeltünk minden kísérlet során. Kontroll mintaként kezeletlen sejtet tartalmazó mélyedéseket, és a PCC00213 anyag esetében 1% DMSO kontrollt alkalmaztunk. Egy nappal a fertőzés előtt a sejteket előkezeltük egér INF-γ-val 100-0,046 IU/ml közötti koncentráció tartományban, kettes léptékű hígítást végezve. Humán IFN-γ-val is kezeltünk sejteket kontrollként, 100-1,5 IU/ml koncentráció tartományban. A fertőzést követően az INF-γ-t cikloheximid mentes tápfolyadékban hígítottuk azonos koncentráció tartományban, mint az előkezelésnél és a már korábban kezelt sejteket az előkezeléssel azonos koncentrációjú hígított IFN-γ-val kezeltük. 3.14 C. trachomatis szaporodásának vizsgálata TiO nanorészecskékkel történt 2 előkezelés után, HeLa sejten 16 mélyedést tartalmazó tárgylemezen kivitelezve C. trachomatis-t (MOI 8) előkezeltük a TiO -dal 100-3,12 µg/ml koncentráció 2 tartományban, kettes léptékű hígítást alkalmazva 1 órán keresztül 37 °C-on. Az előinkubációt fénytől védett helyen végeztük az esetleges fotoktalízis elkerülése érdekében. Kontrollként 2 mélyedést kezeletlen és fertőzött sejtet hagytunk, és 2 mélyedést nem fertőztünk viszont a legmagasabb koncentrációjú TiO (100 µg/m) hígítással kezelt sejtet hagytunk. A sejteket 1 2 órán keresztül, 37 °C-on, 5% CO jelenlétében kezeltük/fertőztük C. trachomatis-szal és 2 TiO -dal. A fertőzést követően a sejteket PBS pufferrel mostuk, majd cikloheximiddel 2 kiegészített tápfolyadékot adtunk a sejtekhez. A lemezeket 48 órán keresztül 37 °C-on, 5% CO jelenlétében inkubáltuk. 2 3.15 Immunfluoreszcens jelölés és szkennelés A C. trachomatis illetve C. pneumoniae 16 mélyedést tartalmazó tárgylemezen fertőzött sejteket immunfluoreszcens jelölést követően értékeltük ki. Chlamydia LPS antitest Alexa- 647 immunfluoreszcens festékkel jelöltük és 1:200 hígításban használtuk a chlamydia inklúziók detektálására. A fluoreszcens jeleket Axon GenePix Personal 4100 DNS chip szkenner és GenePix Pro (6.1 verzió) szoftver (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) segítségével analizáltuk. Az analízis során Cy5 csatornát és 5 µm felbontást használtunk. 3.16 A felvételek kiértékelése A szkennelt felvételeket az általunk kifejlesztett ChlamyCount programmal értékeltük ki. Az analízist 2 részre oszthatjuk: képoptimalizálás és analízis. A kép optimalizálás során, a kép betöltését követően, az ImageJ hisztogram normalizációs lépésével a kontrasztot megemeltük. Az analízis fázisában, a lemez mélyedéseit külön-külön feldolgozza a program. Végezetül az analízis eredményét összefoglaló riportot tölthetünk le txt, xls és pdf fájlok formájában. A pdf fájl tartalmazza a számszerűsített eredményeket és a feldolgozott képeket mind a 16 sejtet tartalmazó területről. 6 3.17 Konfokális mikroszkópos vizsgálat Konfokális lézer mikroszkópot használtunk bizonyos felvételek elkészítéséhez, melyet Olympus FV1000 mikroszkóppal végeztünk. Az Alexa Fluor 647-es festéket 645 és 745 nm között detektáltuk. 3.18 Transzmissziós elektronmikroszkópia használata a korai kapcsolat vizsgálatára a TiO és a HeLa, Vero sejtek között 2 A HeLa 229 és Vero sejteket 6 mélyedést tartalmazó lemezen szaporítottuk, 2x106sejt/mélyedés kezdeti sejtszámmal. A sejteket 100 µg/ml koncentrációjú TiO -dal 2 inkubáltuk (1 h, 37 °C, 5%, CO ), majd 300 µl/mélyedés Tripszin-Versen oldattal oldottuk fel 2 a lemezről. A feloldott sejteket centrifugáltuk, majd a pelletet 600 µl glutáraldehiddel fixáltuk. A fixált sejteket Embed 812-be ágyaztuk. A 70 nm vastag metszeteket az Ultracut S ultra-mikrotómmal metszettük. A festést követően a metszetet JEM-1400 Plus elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. 4 Eredmények 4.1 ChlamyCount szoftver 16 mélyedést tartalmazó szövettenyésztő tárgylemezen növesztett McCoy epitél sejteket használtunk a chlamydiával történő fertőzésekhez. A fertőzést követően (24 vagy 48 óra) a szövettenyésztő tárgylemez műanyag részét eltávolítottuk, majd acetonnal fixáltuk. Az inklúziókat Cy5 analóg Alexa 647-jelölt anti-chlamydiális LPS antitesttel festettük. A megfestett inklúziókat egy Axon GenePix 4100 DNS chip szkenner segítségével szkenneltük. A szkennelt képek feldolgozására a ChlamyCount szoftvert használtuk. A minimum intenzitás küszöbértéke és az inklúziók feltételezett mérete változtatható a vizsgálat során, egyébként minden esetben fix küszöbértékek alapján megy végbe a vizsgálat; a további lépések automatizáltak. Következő lépésként a szoftver a sejtet tartalmazó területeket kivágja a teljes képből. A ChlamyCount szoftver minden területet ugyanazzal a folyamattal analizálja. A kép analízisét követően, a ChlamyCount szoftver részletes txt és xls fájlt készít a 16 területről kapott inkluziók számáról. A harmadik fájl egy automatikusan generált pdf fájl lesz, mely tartalmazni fogja a számszerűsített adatokat és a feldogozott képeket a 16 sejttel borított területről. Az átlagos szkennelési idő 10 perc, a képek feldolgozása 1-5 percet vesz igénybe. 4.2 A C. trachomatis D, L2 és C. pneumoniae detektálás dinamikus tartományának meghatározása a ChlamyCount szoftver használata esetén A ChlamyCount rendszert C. trachomatis D, L2 és C. pneumoniae által fertőzött McCoy sejteken végeztük. Minden esetben felező hígítási sort készítettünk a chlamydia hígítás során. A fertőzés legmagasabb multiplicitása (MOI) 8 volt, de MOI 8 és 1 között a fertőzött terület, festés után összefüggő felületet alkotott, így a szoftver nem tudta megfelelően beolvasni az inklúziók mennyiségét. A későbbi kísérletek során a kezdő multiplicitás 1 (C. trachomatis D és L2) vagy 1:8 (C. pneumoniae) volt, további 6 felező hígítás került a lemezre, kettő párhuzamos ismétlésben. Mind a három chlamydia fajnál magas korrelációt (R2=0,95 és 0,98) mértünk a szoftver által megszámolt és a feltételezett (a felező hígítás görbéjéből számolva) inklúziók száma között. Az inklúziók száma szorosan követte a feltételezett inklúziók számát MOI 1 és MOI 1:8, 1:16 között, amikor nem használtunk a fertőzés során centrifugálást (C. trachomatis D, L2), ami 1-log nagyságrendű dinamikus tartományt eredményezett. A centrifugálás használata (C. pneumoniae) lehetővé tette, hogy alacsonyabb multiplicitást használjunk, viszont szivárgást tapasztaltunk a kísérlet során, így továbbá nem alkalmaztuk ezt az eljárást. 7 4.3 Moxifloxacin, tetraciklin és egy új chlamydia elleni vegyület a PCC00213 minimális gátló hatásának (MIC) vizsgálata C. trachomatis D szaporodására A ChlamyCount szoftver, teszteléseink alapján, ugyancsak alkalmazható MIC érték meghatározására is. A moxifloxacin MIC értéke C. trachomatis fertőzés esetében korábbi kutatások szerint 0,03 és 0,05 µg/ml között van. C. trachomatis D (MOI 1) fertőzés esetében kísérleteink során 0,25-0,04 µg/ml közötti moxifloxacin koncentrációt alkalmaztunk. Eredményeink megmutatták, hogy a C. trachomatis D 0,015 µg/ml-es moxifloxacin koncentrációig szaporodni képes, viszont 0,031 µg/ml koncentrációnál már gátlást figyelhetünk meg. Ezek alapján a moxifloxacin MIC értékét 0,031 µg/ml-nél határoztuk meg. Korábbi adatok alapján C. trachomatis D fertőzés esetében a tetraciklin és a doxyciklin MIC értéke 0,03 és 0,15 µg/ml között van. Kísérleteink során 0,04-0,0006 µg/ml közötti koncentrációt teszteltünk C. trachomatis (MOI 1) fertőzés során. Eredményeink alapján a tetraciklin jelenléte mellett a C. trachomatis D 0,01 µg/ml koncentrációig szaporodni képes, míg 0,02 µg/ml tetraciklin jelenléte mellett gátlást figyelhetünk meg, így a MIC értéket ennél a koncentrációnál határoztuk meg. Az újszerű, PCC00213 jelölésű chlamydia elleni vegyület MIC értékének meghatározásához szintén a ChlamyCount rendszert használtuk. A PCC00213 3,1 µg/ml koncentrációjáig a C. trachomatis szaporodni képes, míg 6,2 µg/ml-nál már gátlást figyelhetünk meg, MIC értékét ennél a koncentrációnál határozzuk meg. Fontos megjegyezni, hogy a párhuzamosan elvégzett MTT teszt kimutatta, hogy a PCC00213 antichlamydiás hatását a sejtek metabolizmusának gátlása is okozhatja. A ChlamyCount alapú vizsgálat mellett készítettünk ugyanilyen lemezeket, melyeket fluoreszcens mikroszkópiával értékeltünk ki. Az abszolút inklúzió szám magasabb volt ennél a kiértékelésnél, mint a ChlamyCount által végzett számolásnál, de még így is magas korreláció volt megfigyelhető meg a két a inklúziószám között (R2=0,94-0,98). Megjegyzendő, hogy a ChlamyCount által és a manuálisan meghatározott MIC értékek azonosak voltak, mindhárom ismétlésben. 4.4 Az IFN- γ C. trachomatis D szaporodására, a DEAE-dextrán és a cikloheximid C. trachomatis D és C. pneumoniae szaporodására gyakorolt hatásának vizsgálata Az IFN–γ triptofán készlet degradáció általi, chlamydia szaporodásra gyakorolt gátlásának jelensége humán sejten jól ismert. Kísérleteinkben a humán és egér IFN-γ hatásának vizsgálatát C. trachomatis fertőzés esetében, McCoy egér fibroblaszt sejteken végeztük. Eredményeink hasonló mértékű gátlást mutatattak a korábbi adatokkal, habár egy alacsonyabb egér IFN-γ koncentrációt használtunk: a chlamydia szaporodásának gátlása koncentrációfüggő volt, és a maximum gátlás megközelítőleg 3,8-szeres volt 1,5 IU/ml (kb. 0,07 ng/ml) vagy magasabb egér IFN-γ jelenlétében. Esetünkben a humán IFN-γ nem mutatott gátlást a legmagasabb, 100 IU/ml koncentrációnál sem. Korábbi megfigyelésünk szerint a gazdasejtek előkezelése DEAE-dextránnal, illetve a cikloheximides kezelés megemelheti a chlamydia zárványokat és a visszatenyészthető IFU-t. Ezen hatásoknak a vizsgálatára a 16 mélyedést tartalmazó tárgylemezt használtuk. A HeLa sejteket előkezeltük DEAE-dextránnal (1% DEAE-dextrán, 15 perc, szobahő), és/vagy 1 µg/ml cikloheximedet alkalmaztunk a fertőzés során, majd a direkt zárványszámot a kezeletlen, fertőzött sejtek eredményeihez hasonlítottuk. Az eredményeink részben különböztek a két chlamydia faj esetében a felsorolt drogokra nézve. A C. trachomatis D esetében a DEAE-dextrán használata csekély hatást mutatott, viszont a cikloheximides kezelés az inklúziók számát 1,9-2,2 szeresére emelte függetlenül a DEAE-dextrán jelenlététől. C. pneumoniae esetében a dextrán és a cikloheximid külön-külön adva emelte a zárványok számát, 2,4 szeresre a dextrán, míg 8 3,3 szeresre a cikloheximid esetében. Az anyagok egyszerre történő adása esetében nem figyeltünk meg szaporodást elősegítő hatást. 4.5 A nanorészecskék töltésmennyisége és morfológiai tulajdonságai A transzmissziós elektronmikroszkópos felvételek alapján a kiindulási TiO 2 nanorészecskék átlagos átmérője 18.4 ± 5,65 nm-nek adódott. A citráttal stabilizált Ag nanorészecskék közel gömb alakúak voltak, az átlagos részecskeátmérőjük 8.2 ± 3,34 nm-nek bizonyult. Az Ag-TiO esetében a szférikus ezüst nanorészecskék a TiO nanorészecskék 2 2 felületén jól láthatóan akkumulálódtak, az átlagos részecskeméretük 21,4 ± 6,78 nm. A TiO 2 pH-függő felületi töltéssel rendelkezik, melynek izoelketromos pontja (i.e.p) pH=6,2. Ezen pH érték felett a TiO felületi töltése negatív, ennek megfelelően a kiindulási -250mV-os 2 felületi töltés Ag-TiO esetében a titrálás során folyamatosan nőtt a felületi töltés 2 elvesztésének következtében. Az Ag-TiO egyedi felületi töltése pH=7,4 esetében -3,54 2 meq/100 g-nak bizonyult. Az Ag-TiO nanorészecskékhez hasonlóan az ezüst és TiO 2 2 nanorészecskék felületi töltését is megmértük, amelyek rendre -19.3 és -184,35 meq/100 g- nak bizonyultak. Az eredmények azt mutatták, hogy a legnagyobb felületi töltése az ezüst nanorészecskéknek volt, míg a TiO és Ag-TiO nanorészecskék esetében kisebb felületi 2 2 töltés alakult ki. 4.6 A TiO , Ag és TiO -Ag nanorészecskék sejtre gyakorolt toxicitásának 2 2 vizsgálata MTT tesztet alkalmaztunk a nanorészecskék toxicitásának vizsgálatára. Eredményeink azt mutatták, hogy egyik nanoanyag sem mutat szignifikáns toxicitást. Maximális toxicitás az Ag nanorészecskék esetében volt megfigyelhető 8-2 µg/ml koncentrációtartományban. Az életképesség maximumát a sejtek az ezüst nanorészecskék jelenlétében 0,5 µg/ml-es koncentrációnál érték el, így ezt a koncentrációt határoztuk meg a maximum nem-toxikus koncentrációnak. A TiO és TiO -Ag NP esetében ezt a koncentrációt 100 µg/ml értéknél 2 2 határoztuk meg. A Vero sejt esetében ugyanez a toxicitási profil volt megfigyelhető. A TiO 2 és TiO -Ag nem volt toxikus az alkalmazott koncentrációkban.A 0,5 µg/ml koncentrációjú 2 Ag nanorészecskével végzett kezelés ~70%-os életképességet eredményezett a sejteken, így a legmagasabb nem-toxikus koncentrációt 0,125 µg/ml-nél határoztuk meg. Annak érdekében, hogy a két sejtvonalon történő fertőzésekből összehasonlítható eredményeket kaphassunk mind a két sejtvonal esetében 100 µg/ml volt a kezdő koncentráció a TiO és TiO -Ag 2 2 esetében, míg 0,5 µg/ml az Ag NP esetében. 4.7 A TiO , TiO -Ag és Ag NP-k hatásának vizsgálata direk qPCR segítségével 2 2 C. trachomatis és HSV-2 fertőzött sejteken Direkt qPCR módszer alkalmaztunk a nanorészecskék antimikrobás hatásának bizonyítására C. trachomatis és HSV-2 fertőzés esetében. A qPCR során pozitív kontrollként kezeletlen, C. trachomatis-szal fertőzött sejteket használtunk, melyeknek Ct értéke 26,81 +/- 0,64 volt. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a TiO fokozta a C. trachomatis 2 szaporodását a kontrollhoz képest. A növekedésemelkedés koncentrációfüggést mutatott, maximum TiO koncentráció (100 µg/ml) esetében a Ct érték 24,85 +/- 0,64 értéket vett fel. 2 Az 1,96 qPCR ciklus különbség a TiO -dal kezelt és a kezeletlen minták DNS mennyisége 2 között megközelítőleg ~3,89 szeres (~21,96) szaporodásemelkedést jelent. Az Ag nanorészecskékkel kezelt C. trachomatis esetében erős gátló hatást figyelhetünk meg 0,5-0,031 µg/ml koncentráció tartományban. Másrészt, a TiO -Ag NP 2 9 esetében csökkent antimikrobás aktivitást figyelhetünk meg az Ag nanorészecskékkel szemben a C. trachomatis fertőzés esetén, mindazok ellenére, hogy a TiO -Ag ugyanannyi 2 mennyiségű Ag-t tartalmazott, mint az Ag nanopartikulumok. A legkifejezettebb különbség a két anyag antimikrobás hatása között a 25 µg/ml és 6,25 µg/ml TiO -Ag NP koncentrációknál 2 volt, ahol is a növekedés különbség az Ag NP és TiO -Ag NP kezelt chlamydia esetében 2 15,59 és 27,92 szeres volt. 4.8 A TiO szaporodást fokozó hatásának időbeli függése C. trachomatis 2 esetében Kísérleteink során szerettük volna meghatározni azt az időtartamot a fertőzések során, mely időtartam alatt befolyásolja a TiO a C. trachomatis szaporodását. Ezen időtartam 2 meghatározására a következő kísérletet végeztük el: i,a TiO -t együtt inkubáltuk a C. 2 trachomatis elemi testekkel egy órán keresztül a fertőzést megelőzően, majd a fertőzés alatt együtt inkubálódtak a sejteken újabb egy órán keresztül, ii, a TiO és a C. trachomatis elemi 2 testek egy órán át inkubálódtak együtt a fertőzés folyamán iii.a fertőzést követően adtuk a TiO -t a sejtekhez különböző időpontokban (0-32 óra). Centrifugálást nem használtunk a 2 fertőzések alatt. Eredményeink alapján, a TiO növekedés serkentő hatását az előinkubálást követő 2 fertőzés során (~ 2 qPCR ciklus, négyszeres növekedés), illetve abban az esetben is megfigyeltük, amikor az egy órán át tartó fertőzés során adtuk a TiO -t a sejtekhez és a C. 2 trachomatis-hoz (~2 qPCR ciklus, négyszeres növekedés). 4.9 A TiO , Ag és TiO -Ag nanorészecskék qPCR-re gyakorolt közvetlen 2 2 hatásának meghatározása Mivel a növekedéshez kapcsolt chlamydia DNS mennyiségét direkt qPCR metodikával mértük, kíváncsiak voltunk a nanorészecskék közvetlen hatására a qPCR során alkalmazott DNS polimerázzal szemben. A qPCR enzim gátlásának esetében hamis chlamydia ellenes hatásról kaphatunk információt, míg egy stimuláló hatás hamis chlamydia növekedésről adhat információt. Abban esetben, ha nincs számottevő hatása a TiO -nak az enzimre, a fertőzött 2 sejtek és a fertőzetlen, de kezelt sejtek lizátumának keveréke azonos Ct értéket ad a PCR során, mint fertőzött és kezeletlen sejtek lizátumának keveréke. 4.10 A TiO C. trachomatis-ra gyakorolt hatásának vizsgálata kvantitatív 2 fluoreszcencia segítségével. Egy független immunfluoreszcens vizsgálati módszert használtunk a qPCR eredményeink alátámasztása érdekében. A HeLa sejteket 16 szeparált mélyedéssel rendelkező sejttenyésztő tárgylemezen tenyésztettük, majd a C. trachomatis-szal végzett fertőzést (MOI 8) is ezen a lemezen vittük véghez az egy órás előinkubációt követően, különböző koncentrációjú nanorészecskékkel. Centrifugálás nélkül végeztük a fertőzést. Fertőzött, de kezeletlen illetve kezelt, de nem fertőzött (100 µg/ml TiO ) sejteket használtunk kontrollként 2 a lemezeken. A chlamydia zárványokat Alexa-647 festékkel jelölt anti-chlamydia LPS ellenanyaggal festettük meg. Ahogy korábban leírtuk a lemezeket DNS-chip szkenner segítségével szkenneltük, majd a ChlamyCount szofvert használtuk a zárványok számának meghatározásához. A ChlamyCount által megszámolt zárványok mennyisége alátámasztotta a qPCR által kapott eredményeinket. A chlamydia elemi testek TiO -dal való előkezelése emelkedést indukált a zárványok 2 számában. a TiO 100 és 50 µg/ml-es koncentrációja esetében 400-500%-os emelkedést 2 figyelhetünk meg, viszont ez a növekedést serkentő hatás koncentrációfüggő, melyet a 25- 10 3,12 µg/ml koncentrációknál figyelhetünk meg a serkentő hatás csökkenésének formájában. A fertőzetlen, de TiO nanorészecskékkel kezelt sejtek elhanyagolható pozitivitást mutattak, 2 ezzel bizonyítva azt, hogy a megfigyelt növekedett chlamydia immunfluoreszcenciát nem az ellenanyag TiO2 nanorészecskékhez való aspecifikus kötődése okozta. 5 Diszkusszió 5.1 1. célkitűzés: Egy automatizált rendszer kifejlesztése chlamydia zárványok detektálására és számolására: ChlamyCount szoftver Alacsony költségű, közepes teljesítményű metodikát fejlesztettünk ki a chlamydia zárványok meghatározására. A 16 szeparált mélyedést tartalmazó tárgylemezen szaporított chlamydia zárványait fluoreszcensen jelölt gén-specifikus elleanyaggal jelöltük, majd DNS chip szkenner segítségével készítettünk felvételt a tárgylemezről. Az általunk összeállított detektáló rendszerben a DNS chip szkenner a legdrágább komponens; habár ezek a szkennerek könnyen hozzáférhetőek és gyakran használt eszközök, a mai újgenerációs szekvenálási technikák megjelenése miatt jelenleg kevésbé használtak vagy fölöslegessé vált eszközök. Az általunk fejlesztett technika új szerepbe helyezi a DNS chip szkennereket, a nagyfelbontású képek készítésében és a chlamydia zárványok detektálásában váltak használhatóvá. Az elkészült képeket közel teljes mértékben automatikusan dolgozzuk fel egy szoftver segítségével, mely nem igényel nagyteljesítményű asztali gépet. A zárványok számolására „gold standard”-ként felező hígítással hígított chlamydiával fertőzött sejteken elvégzett számolást használtunk. A metodika képes volt az 1:2-es hígítású zárványok megszámolására három különböző chlamydia faj esetében és magas korrelációt mutatott a feltételezett zárványszámmal szemben. A rendszer képes volt meghatározni a zárványok mennyiségét 1-log egységen belül, ami hasonló vagy valamivel jobb, mint a korábban leírt metodikák. Más módszerekkel szemben, a ChlamyCount-nak az a hátránya, hogy nagyobb multiplicitású fertőzés esetén, szinte összefüggő fluoreszcens jellel rendelkező területet nem képes megvizsgálni, nem tudja meghatározni a zárványok számát. Ez a jelenség a zárványok tömörülésének köszönhető. A ChlamyCount magasabb zárványszámot határozott meg, mint a manuális számolás során kapott eredmények, ez annak köszönhető, hogy a szoftver kisebb, fluoreszcens jelet adó egységeket is zárványként azonosított. Tehát a szoftver jelenlegi verziója nem használható a zárványok abszolút számának meghatározásához. A ChlamyCount megfelelően használható különböző chlamydia növekedést befolyásoló anyag hatásának vizsgálatára, mivel ebben az esetben a kezelések közötti különbségekre vagyunk kíváncsiak és nem szükséges tudni az abszolút zárványszámot. Valójában, bizonyítani tudtuk, hogy a meghatározott zárványok száma korrelációt mutatott a manuális és a ChlamyCount-tal végzett számolás során, mely alapján megfelelő lehet a bakteriális zárványszámok közötti különbségek meghatározására, mely MIC értékek meghatározása szempontjából fontos. Két jól ismert, különböző mechanizmuson alapuló antibiotikum MIC értékének maghatározására használtuk rendszerünket: a riboszóma gátló tetracyclin és a giráz gátló moxifloxacin. Mindkét esetben meghatároztuk a MIC értékeket a szoftver segítségével, melyek hasonlóak voltak a manuális számolás után kapott eredményekkel, és a korábban leírt értékekkel. A ChlamyCount képes volt reprodukálhatóan meghatározni az új chlamydia ellenes anyag, a PCC00213 MIC értékét is. Az antibiotikumok mellett más anyagok, például külünböző kémiai vegyületek és citokinek is képesek befolyásolni a chlamydia növekedését. Az IFN-γ már korábban leírt hatását is kimutattuk módszerünk segítségével, és bizonyítani tudtuk a DEAE-dextrán és cikloheximide chlamydia- ra gyakorolt növekedést serkentő hatását. Ezen kísérletekből kapott eredmények megmutatták, hogy a ChlamyCount szoftverrel képesek vagyunk kimutatni a kontroll és kezelt mintákban a zárványok számbeli különbségét. Ez a fajta relatív mennyiségi