N° d’ordre : 2245 THÈSE présentée pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE SPÉCIALITÉ : Sciences des Agroressources par María de la Soledad ALONSO GUTIÉRREZ Valorisation de la bagasse de l’agave tequilana W. cv azul : caractérisation, étude de la digestibilité et de la fermentation des sucres Soutenue le 6 septembre 2005 devant le jury composé de : Rapporteurs : Mme A. BOUNIOLS Directeur de Recherche INRA Toulouse M. E. CASTRO GALIANO Professeur à l’Université de Jaen, Espain M. P. BLANC Ingénieur de Recherche INSA Toulouse Examinateurs : MM. A. GASET Professeur à l’Institut National Polytechnique de Toulouse L. RIGAL Ingénieur de Recherche à l’ENSIACET, Institut National Polytechnique de Toulouse Laboratoire de Chimie Agro-Industrielle – UMR 1010 INRA/INP-ENSIACET 118, route de Narbonne – 31077 Toulouse Cédex 04 RÉSUMÉ La bagasse d’agave tequilana W cv azul est le sous-produit solide de l’extraction des sucres, essentiellement l’inuline, de la tête d’agave tequilana, pour la fermentation éthanolique et la distillation de la tequila. Les caractéristiques physiques, la structure microscopique et la composition chimique de la tête d’agave tequilana fraîche et de la bagasse fraîche et séchée sont étudies. La bagasse contient entre 5 et 20% de sucres libres selon sont état de siccité, et est constituée par plus de 80% des fibres, dont 56 % de cellulose, 24,3 % de hémicelluloses et 19,5 % de lignine. La digestibilité in vivo de la bagasse d’agave tequilana peut être améliorée pour des traitements chimiques [NaOH, Ca(OH) , NH OH], physico-chimique à la 2 4 vapeur d’eau ou biologiques avec le champignon Pachysolen tannophilus jusqu’à des valeurs de près de 65 %, équivalentes à celle de la luzerne. La fermentation des sucres libres résiduels de l’extraction aqueuse de la fibre d’agave avec la levure Saccharomyces cerevisiae permet d’obtenir des concentrations en éthanol de 7.2 g/L avec un rendement de 40 % par rapport á la matière sèche de la bagasse d’agave fraîche. L’hydrolyse acide des hémicelluloses de la bagasse sèche dans des conditions douce de température (95°C) et de concentration en acide sulfurique et chlorhydrique (1N) conduit á des hydrolysats riches en pentose (xylose et arabinose) et en hexose (glucose, fructose et galactose). La fermentation des ses sucres par Pachysolen tannophilus conduit à des concentrations en éthanol de 10 g/L et en xylitol de 2,9 g/L, avec des rendements par rapport à la matière de la bagasse sèche respectivement de 56% et de 13%. ABSTRACT. The agro-industrial Agave tequilana bagasse byproduct from the tequila industry, was physical and chemical characterized. The physical characteristics indicated that these residues to be composed of heterogeneous fibrous and not fibrous organic material in form of fines particles. The chemical analysis show a content in cellulose of 43 %, lignin 15%, hemicelluloses 19 %, total nitrogen matter 3%, pectin 1 %, fatty 1 %, reducing sugar 5-10 % and ashes 6 %. In accord with these results we studied the different proceeding of valorization: Sugar free was fermented by Saccharomyces cerevisiae to produced ethanol (7,2 g/L); hemicellulosic hydrolyzed obtained by acid hydrolysis (H SO , HCl, 0.1-1N 95°C) was fermented 2 4 by Pachysolen tannophilus to produce ethanol (10 g/L) and xylitol (2.9 g/L); alkaline extraction (NaOH 5 %) of hemicelluloses for paper production; chemical (NaOH, Ca(OH) , NH OH) and biologic (Phanerochaete crysosporium) 2 4 pretreatment to increase bagasse’s digestibility. ¿Que es la vida ?….Es un caminar atravéz de caminos que se van formando a nuestro paso donde encontramos alegrías, tristezas, nacimientos, pérdias, en fin una experiencia que nos llena de amor y este nos sostiene y nos hace ser felices. A LA MEMORIA DE MIS PADRES : Manuel y Soledad, quienes me apoyaron con amor y paciencia todo el camino de mi vida hasta el último momento de su existencia en este plano, y con quienes continuo unida através del amor y esperando volver a verlos algún día en esa otra dimension a la que partieron. A MI FAMILIA : Clementina, Anita, Mary, Manuel, Cristina, Bety, Fello, Laura, Malán, Rosy, Manuel Felipe, Karla, Roberto, Florecita, Karina, David, Malancito y Fany, con quienes he compartido mi vida, sosteniendonos en el dolor las tristezas y las pérdidas de los padres o abuelos o bisuabuelos, disfrutado las alegrías y los nuevos nacimientos, todos unidos por el gran amor que nos tenemos. Les recherches qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisées au sein du Laboratoire de Chimie Agro-industrielle UMR 1010 INRA de l’École Nationale Supérieure des Ingénieurs en Arts Chimiques et Technologiques de l’INP de Toulouse, dirigé par Monsieur le Professeur A. Gaset. Monsieur le Professeur A. Gaset, je tiens à vous exprimer toute ma gratitude pour m’avoir accueillie au sein de votre laboratoire. J’ai apprécié toute la confiance dont vous avez fait preuve envers moi. Monsieur L. Rigal, vous qui avez contribué à l’encadrement scientifique de ce travail, je vous remercie pour la confiance que vous m’avez accordée pendant la réalisation de ce travail. Je tiens à vous témoigner ma reconnaissance pour l’ensemble de vos conseils scientifiques ainsi que pour l’aide que vous m’avez apportée lors de l’élaboration de ce manuscrit. Monsieur P. Blanc je vous remercie de m’avoir accueillie dans votre laboratoire de Biotechnologie de l’Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse, pour réaliser une partie de ce travail. Aussi je vous remercie pour avoir accepté d’être rapporteur de ce mémoire. Monsieur E. Barzana je vous remercie de m’avoir accepté dans votre laboratoire de Alimentos y Biotecnología de l’UNAM au México D.F, pour la réalisation d’une partie de ce travail. Monsieur V. Zúñiga, je vous remercie de m’avoir acceptée dans votre laboratoire de Biotecnología del Instituto de Madera Cellulosa y Papel de la Universidad de Guadalajara, Jalisco, pour la réalisation d’une partie de ce travail. Monsieur E. Castro Galeano, je vous remercie de m’avoir acceptée dans votre laboratoire de Ingeniería química, Ambiental y de los Materiales à l’Universidad de Jaen, España. Je tiens à vous témoigner ma reconnaissance pour tout votre appui pendant mon stage dans votre laboratoire et aussi pour avoir accepté d’être rapporteur de ce travail. Madame A. Bouniols, Directeur de Recherche INRA Toulouse, je vous exprime toute ma reconnaissance pour avoir accepté d’être rapporteur de ce travail. Je voudrais remercier Marie-Chistine Talou pour sa patience et sa disponibilité au cours de la mise en page de ce manuscrit. Evelyne, Sophie, Jorge, Virginie, Katy, Isabelle, Lucita, León, Yao, Fabian merci pour votre amitié. INTRODUCTION 2 Exploitées depuis fort longtemps par les premiers habitants de l’Amérique Centrale, les agaves sont des plantes qui font partie de la culture mexicaine et de l’imagerie traditionnellement associée à ce pays. Remarquablement bien adaptées à un environnement semi-aride, certaines variétés ont été sélectionnées et sont cultivées depuis de nombreuses années. C’est en particulier le cas de l’agave tequilana W. cv azul, exploitée pour la production de tequila, autre produit fortement associé à la tradition culturelle mexicaine. La croissance de la production de tequila, en particulier pour l’exportation, s’est traduite par le développement de distilleries industrielles, qui représentent, avec les distilleries artisanales traditionnelles, une capacité de traitement de 0,5 million de tonnes d’agave par an, récoltées au bout de 6 à 9 ans, sur plus de 40 000 hectares cultivés. Mais pour un litre de tequila, produite à partir de la tête d’agave, près de 0,8 kg de résidu solide d’extraction des sucres sont produits. Ce co-produit, appelé bagasse d’agave, qui représente un gisement de plus de 0,1 million de tonne par an, concentré sur les sites de fabrication de tequila, est actuellement abandonné sur des sites spécifiques et n’est pratiquement pas valorisé. C’est à la recherche de nouvelles voies de valorisation de la bagasse d’agave tequilana W. cv azul que les travaux, présentés dans ce mémoire, ont été consacrés. Après avoir décrit l’ensemble des connaissances sur l’agave, sa culture et sa transformation, dans le premier chapitre de ce mémoire, nous nous attacherons, dans le second chapitre, à caractériser la bagasse et la tête d’agave dont elle provient, en vue de sélectionner les voies de transformation qui permettraient de développer de nouvelles valorisations, compatibles avec l’environnement agricole et technologique de la culture de l’agave et de la production de tequila. Ainsi, dans le troisième chapitre, l’utilisation de la bagasse sèche comme fourrage, pour l’alimentation des ovins, sera étudiée à travers la détermination des digestibilités, sans ou avec prétraitement. 3 Le quatrième chapitre sera consacré à l’étude de la valorisation des sucres libres, en particulier de la bagasse fraîche, à travers leur fermentation éthanolique, facilement intégrable dans le procédé de fabrication de la tequila. Enfin, la valorisation de la bagasse sèche sera étudiée, dans le dernier chapitre, à travers l’hydrolyse des hémicelluloses et la transformation des pentoses et des hexoses en xylitol et en éthanol. CHAPITRE I L’AGAVE, UNE PLANTE TYPIQUEMENT MEXICAINE