_____________________________________________________________ ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA (D.L.vo 30.06.1993 n. 270) CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER LE MALATTIE DEGLI EQUINI CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER L’ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUIDI SEDE CENTRALE Via Appia Nuova, 1411 – 00178 Roma/Capannelle Tel. (06) 79099.1 (centralino) – Fax (06) 79340724 http://www.izslt.it - E-mail: [email protected] VALIDAZIONE DI UN KIT ELISA INDIRETTO PER LE INFEZIONI DA EQUINE INFECTIOUS ANEMIA PRODOTTO DAL DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI, EPIDEMIOLOGIA ED ECOLOGIA (D.P.A.E.E.), FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA, UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TORINO: REPORT DEFINITIVO REDATTO DA: GIAN LUCA AUTORINO, ROBERTO NARDINI, MARIA TERESA SCICLUNA _____________________________________________________________ _______________________________________________________INDICE INDICE ____________________________________________________________1 _______________________________________________________INDICE INTRODUZIONE____________________________________________3 VALIDAZIONE______________________________________________7 1.1 Idoneità allo scopo__________________________________________8 1.2 Idoneità all’utilizzo______________________________________8 2. Ottimizzazione e standardizzazione_______________________9 3. Caratteristiche di performance analitica_________________9 3.1 Specificità analitica____________________________________9 3.2 Sensibilità analitica____________________________________10 4 Caratteristiche di performance diagnostiche____________13 4.1 Sensibilità e specificità diagnostica, valore predittivo positivo e negativo_______________________________________13 5.Ripetibilità______________________________________________15 6. Riproducibilità__________________________________________21 CONCLUSIONI____________________________________________23 BIBLIOGRAFIA____________________________________________25 ____________________________________________________________2 ________________________________________________INTRODUZIONE INTRODUZIONE ____________________________________________________________3 ________________________________________________INTRODUZIONE L'Anemia Infettiva Equina (AIE) è un 'infezione ad eziologia virale degli equidi, sostenuta da un virus della famiglia Retroviridae, genere Lentivirus. La trasmissione del virus dell’AIE avviene di solito attraverso veicoli biologici e meccanici. I veicoli biologici sono riconosciuti in varie specie di insetti ematofagi, appartenenti alle famiglie Tabanidae, Hippoboscidae e Muscinae; comunemente conosciuti rispettivamente come tafani, mosche cavalline e mosche domestiche [1;2]. I veicoli meccanici principali sono gli interventi terapeutici/chirurgici effettuati senza rispettare le norme di biosicurezza. Dal 2006, l'Italia attua un piano nazionale di sorveglianza per AIE [3;4;5] che prevede un controllo sierologico di tutta la popolazione equina, ad eccezione degli animali allevati esclusivamente per la produzione di alimenti. I soggetti confermati positivi devono essere isolati rispettando norme di biosicurezza volte ad evitare la trasmissione dell'infezione. La diagnosi sierologica di questa infezione, secondo il D.M. 4/12/1976, deve essere effettuata dagli IIZZSS competenti territorialmente e confermata dal Centro di Referenza Nazionale. Il test di conferma è l'immunodiffusione in gel di Agar (AGID), come descritto da Coggins e dal Manuale OIE [6;7]. Questa tecnica è di semplice esecuzione ma ha un limite di rilevabilità elevato: campioni con bassi titoli anticorpali possono non presentare linee di precipitazione o formare linee di difficile interpretazione. Infatti, nei casi di debole positività, la soggettività di interpretazione dell'operatore, come anche l’eccesso di antigene utilizzato nella prova, possono influire in maniera determinante sull'esito. Il suo limite di rilevabilità ha reso opportuno lo sviluppo di nuovi protocolli diagnostici, di semplice esecuzione e che presentassero una maggiore sensibilità. Il Manuale OIE contempla la tecnica ELISA come metodo di diagnosi sierologica alternativo, l’Immunoblotting (IB) come metodo di conferma alternativo e metodi diagnostici di biologia molecolare (PCR) in caso di risultati discordanti tra i metodi sierologici [8] . L'IB, per le sue caratteristiche di esecuzione, e la PCR, anche per le caratteristiche di variabilità genetica e della viremia nell'infezione da AIEV, non sono adottabili come test di screening. Il kit oggetto di validazione è costituito da piastre sensibilizzate con antigeni ricombinanti gag ed env di EIAV. ____________________________________________________________4 ________________________________________________INTRODUZIONE La procedura prevede:  Dispensazione di 95 μl di tampone di diluizione dei sieri  Dispensazione di 5 μl di controlli e di sieri in esame  Incubazione per 60 minuti a 37°C  3 cicli di lavaggio con soluzione di lavaggio  Dispensazione di 100 μl di coniugato (anticorpo anti IgG di cavallo coniugato con perossidasi)  Incubazione per 60 minuti a 37°C  3 cicli di lavaggio con soluzione di lavaggio  Dispensazione di 100 μl di substrato  Incubazione a temperatura ambiente per 15 minuti  Dispensazione di 100 μl di soluzione di stop  Lettura spettrofotometrica ad una lunghezza d’onda di 405 nm I criteri di validazione sono i seguenti:  La densità ottica (DO) del controllo positivo deve essere >0,4  Il rapporto tra DO del controllo positivo e negativo deve essere >3 Per l’interpretazione dei risultati si deve calcolare per ogni siero la percentuale di reattività secondo la formula: DO -DO R= Campione Controllo Negativo X100 DO -DO Controllo Positivo Controllo Negativo Sieri con reattività ≥ 50% sono considerati positivi Sieri con reattività ≤ 40% sono considerati negativi Sieri con reattività compresa fra 40% e 50% sono considerati dubbi ____________________________________________________________5 ________________________________________________INTRODUZIONE Questa validazione è stata condotta seguendo i criteri di validazione riportati nel Manuale OIE [9] e riassunti in tabella 1. Tabella 1: Criteri di validazione secondo OIE 1. Idoneità allo scopo prefissato ed all’utilizzo 2. Ottimizzazione 3. Standardizzazione 4. Sensibilità analitica 5. Specificità analitica 6. Robustezza intralaboratorio 7. Ripetibilità 8. Sensibilità diagnostica 9. Specificità diagnostica 10. Riproducibilità 11. Robustezza interlaboratorio ____________________________________________________________6 _________________________________________________VALIDAZIONE VALIDAZIONE ____________________________________________________________7 _________________________________________________VALIDAZIONE 1.1 Idoneità allo scopo Tra gli scopi elencati nel manuale OIE il kit in oggetto ha può essere adatto allo scopo di:  Accertare la presenza/assenza dell’agente patogeno in animali soggetti a movimentazione;  Eradicare la malattia da una popolazione definita;  Stimare la prevalenza. 1.2 Idoneità all’utilizzo Oltre che da un punto di vista scientifico, la valutazione di un test deve comprendere anche tutti gli aspetti tecnici e pratici che riguardano il suo impiego e che condizionano la sua accettabilità da parte degli utilizzatori. I requisiti considerati sono i seguenti: Disponibilità delle attrezzature: attualmente la tecnica ELISA è largamente adottata presso tutti i laboratori e gli stessi sono dotati dei materiali di consumo e delle apparecchiature necessarie all’esecuzione. Livello di preparazione tecnica e facilità di interpretazione: la procedura di esecuzione richiede il medesimo livello di preparazione necessario all’utilizzo di qualsiasi altro kit ELISA. L’interpretazione della prova si basa su 2 criteri di validazione e sull’applicazione di una formula per il calcolo dei valori di soglia e della reattività dei campioni in esame, che risulta di facile sviluppo. Ogni campione è qualificato inequivocabilmente ed in modo oggettivo. Disponibilità dei reagenti: il kit è già completo di tutti i reagenti necessari per l’esecuzione della prova. Requisiti di trasporto: il kit necessita di essere mantenuto ad una temperatura di +4°C, requisito attualmente assicurato dalle principali ditte di spedizioni. Sicurezza e biosicurezza: in condizioni di norme generali di sicurezza tutte le fasi di esecuzione non comportano rischi per l’operatore. I sieri positivi di riferimento potrebbero rappresentare un veicolo di infezione dell’AIEV se inoculati a soggetti suscettibili. Per questo si raccomanda un utilizzo esclusivo ed uno smaltimento a norma di legge. Tempo di risposta: il tempo necessario per ottenere l’esito di un campione è di circa tre ore, mentre per l’AGID risulta compreso tra 24 e 48h. ____________________________________________________________8 _________________________________________________VALIDAZIONE Costo per analisi: non è stato possibile valutarlo in quanto non disponibili al momento della validazione. 2. Ottimizzazione e standardizzazione Queste due fasi sono state effettuate dal DPAEE (documento di validazione interna disponibile su richiesta). 3. Caratteristiche di performance analitica 3.1 Specificità analitica La specificità analitica definisce quanto il test distingue tra l'analita target e altri componenti presenti nella matrice, a tre livelli diversi. Questi tre livelli possono essere espressi dai concetti di selettività, esclusività ed inclusività. La selettività si riferisce a quanto il metodo può individuare l'analita target, in presenza di interferenze di diversa natura (componenti della matrice, sostanze degradanti, legami aspecifici di reagenti a una fase solida, anticorpi vaccinali). Inoltre per valutare la selettività è stata effettuato un confronto tra una prova col lavaggio come previsto da procedura e prova con lavaggio con solo acqua ultrapura esaminando 24 sieri positivi e 26 sieri negativi . Il confronto tra la metodica standard e quella modificata è esemplificato nel grafico 1. È stata rilevata tramite il test di Student una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi di sieri positivi (p<0.01); mentre trai due gruppi di sieri negativi la differenza non è risultata significativa (p= 0,568). ____________________________________________________________9