UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Zorica S. Šarac UTVRĐIVANJE VARIJABILNOSTI I DIFERENCIJACIJE PRIRODNIH POPULACIJA PINUS NIGRA ARNOLD U SRBIJI KORIŠĆENJEM FITOHEMIJSKIH I MOLEKULARNIH MARKERA doktorska disertacija Beograd, 2014 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Zorica S. Šarac DETERMINATION OF VARIABILITY AND DIFFERENTIATION OF NATIVE POPULATIONS OF PINUS NIGRA ARNOLD IN SERBIA USING PHYTOCHEMICAL AND MOLECULAR MARKERS Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 KOMISIJA: _______________________________ Prof. dr Petar D. Marin, redovni profesor, Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, Mentor _______________________________ Dr SrŤan Bojoviš, nauţni savetnik, IBI "Siniša Stankoviš" Univerziteta u Beogradu, Mentor _______________________________ Dr Jelena M. Aleksiš, nauţni saradnik, Institut za molekularnu genetiku i genetiţko inţenjerstvo u Beogradu _______________________________ Dr Biljana Nikoliš, viši nauţni saradnik, Institut za šumarstvo u Beogradu _______________________________ Prof. dr PeŤa Janaškoviš, vanredni profesor, Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, Datum odbrane: Beograd, _____________________ Ova doktorska disertacija je urađena na: Katedri za morfologiju i sistematiku biljaka, Biološkog fakulteta u Beogradu, Institutu za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Katedri za organsku hemiju, Hemijskog fakulteta u Beogradu, Departmanu za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakultet u Nišu. Doktorska disertacija je realizovana je u okviru tri projekta Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije br. 173029, 173011 i 172053. Izradom doktorske disertacije rukovodili su dr Petar D. Marin, redovni profesor Biološkog fakulteta u Beogradu i dr Srđan Bojović, naučni savetnik IBI "Siniša Stanković" u Beogradu, kojima dugujem najveću zahvalnost na nesebičnoj podršci i pomoći u svim etapama izrade ove disertacije. Posebnu zahvalnost dugujem i dr Jeleni Aleksić, naučnom saradniku na Institutu za molekularnu genetiku i genetičko inžinjerstvo u Beogradu, na dragocenoj pomoći u realizaciji molekularnih analiza i interpretaciji dobijenih rezultata. Takođe, zahvalnost dugujem i ostalim članovima Komisije za ocenu doktorske disertacije dr Biljani Nikolić sa Instituta za šumarstvo u Beogradu i prof. dr Peđi Janaćkoviću sa Biološkog fakulteta u Beogradu. Od velikog značaja za izradu ove disertacije je i stručna pomoć prof. dr Veleta Teševića i svih članova Laboratorije za instrumentalnu analizu Hemijskog fakulteta u Beogradu, kojima se ovom prilikom od sveg srca zahvaljujem. Zahvalnost želim da izrazim i kolegama sa Katedre za morfologiju i sistematiku biljaka, Biološkog fakulteta u Beogradu, Tanji Dodoš i Nemanji Rajčeviću, na dragocenoj pomoći i odvojenom vremenu za molekularne analize. Zahvalnost dugujem i prof. dr Dmitru Lakušiću sa Biološkog fakulteta u Beogradu na dragocenim sugestijama i pomoći u statističkoj obradi molekularnih rezultata. Najtoplije se zahvaljujem i prof. dr Vladimiru Ranđeloviću i docentu dr Bojanu Zlatkoviću sa Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, koji su me uveli u svet botanike i dali brojne praktične savete u izradi ovog rada. Hvala i svim kolegama sa Departmanu za biologiju i ekologiju, Prirodno- matematičkog fakulteta u Nišu koji su na bilo koji način pomogli u izradi ove disertacije. Beskrajnu zahvalnost dugujem svojoj porodici i prijateljima koji su me razumeli, bodrili i na sve načine pomagali da istrajem u ostvarenju svoga cilja. Zorica Šarac UtvrĊivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera REZIME U ovom radu analizirana je fitohemijska i genetiţka varijabilnost i diferencijacija sedam autohtonih populacija Pinus nigra u Srbiji koje pripadaju razliţitim infraspecijskim taksonima (ssp. nigra, var. gocensis, ssp. pallasiana i var. banatica). U dvogodišnjim ţetinama 195 jedinki iz sedam populacija odreŤen je sadrţaj i varijabilnost n-alkana i terpena. Kutikularne voskove ţetina istraţivanih populacija crnog bora odlikuje serija n- alkana od C do C , osim u populacijama opisanim kao ssp. nigra u kojima je 16 33 detektovana serija od C do C . Najzastupljeniji su n-alkani sa neparnim brojem C 18 33 atoma: C , C , C i C (proseţni sadrţaj 10.3, 16.5, 15.1 i 10.7%, respektivno). U 23 25 27 29 etarskim uljima ţetina utvrŤeno je ukupno 75 komponenti, od koji je 58 identifikovano. Dominantne komponente su α-pinen (43.6%) i germakren D (29.8%), koje zajedno ţine 73.4% mase ulja. Multivariacione statistiţke analize (PCA, CDA i HCA) koriššenih fitohemijskih markera su, generalno, pokazale tendenciju formiranja tri grupe populacija (nigra, pallasiana i banatica). Na osnovu varijabilnosti terpena, populacije Priboj i Goţ (determinisane kao var. gocensis) pokazale su umerenu tendenciju odvajanja od prve grupe (ssp. nigra), dok je prema sastavu n-alkana populacija Priboj pokazala još vešu tendenciju odvajanja. Pretpostavljeno je da takson gocensis predstavlja tranzicionu formu izmeŤu taksona nigra na zapadu i pallasiana na jugoistoku Srbije. U cilju odreŤivanja genetiţkog diverziteta i diferencijacije sedam istraţivanih populacija P. nigra iz Srbije, testirano je 114 jedinki pomošu jedarnih (nuDNK), hloroplastnih (cpDNK) i mitohondrijalnih (mtDNK) markera koji imaju bi-parentalno, paternalno i maternalno nasleŤivanje, respektivno, kao i razliţitu brzinu evolucije. Zbog nedostatka jedarnih mikrosatelita (nuSSRs) specijalno razvijenih za P. nigra, uraŤena je inter-specijska PCR amplifikacija tri EST-SSRs razvijenih za P. taeda. Iako su dva EST- SSR lokusa uspešno PCR-amplifikovana u našim uzorcima, utvrŤeno je odsustvo varijabilnosti zbog ţega su iskljuţeni iz dalje analize. Od pet testiranih cpDNK SSRs, tri su uspešno PCR-amplifikovana u našim uzorcima, sa 22 detektovana alela koji formiraju 38 haplotipova. Kao što je i oţekivano, s obzirom na intenzivan protok gena posredstvom polena kod ţetinara, utvrŤen je veoma visok nivo cpDNK diverziteta (H = 0.949) i mali T stepen diferencijacije (Fst = 0.017, p = 0.108, Gst = 0.024, Rst = 0.066). Klaster analize koje se ne zasnivaju na genetiţkim distancama veš na Bayesian metodi (STRUCTURE i TESS) su, takoŤe, pokazale da sve ispitivane populacije P. nigra predstavljaju samo jednu genetiţku grupu na osnovu varijabilnosti hloroplastnog genoma. Sa druge strane, PCA analize, zasnovane na frekvenci cpSSR alela i haplotipova, i NMDS analiza, zasnovana na vrednostima genetiţke diferencijacije parova populacija, pokazale su da se populacije ssp. nigra, ssp. pallasiana i var. banatica mogu posmatrati kao tri zasebne grupe po tipu varijabilnosti. Osnovna razlika izmeŤu PCA analize zasnovane na frekvenci haplotipova i NMDS analize, sa jedne strane, i PCA analize bazirane na frekvenci alela, sa druge strane, ogleda se u tome što prve dve analize ukazuju i na drugaţiji tip varijabilnosti populacije Priboj (var. gocensis). Od tri testirana mtDNK lokusa samo jedan (nad 7 intron 1) uspešno je PCR-amplifikovan u našim uzorcima, pri ţemu su detektovana dva haplotipa što je rezultovalo u niskom mtDNK diverzitetu (H = 0.357), ali umerenoj genetiţkoj T diferencijaciji (Gst = 0.359), rezultat koji je saglasan sa asimetriţnim protokom gena kod ţetinara. TakoŤe, na osnovu mtDNK genoma, bilo je moguše napraviti distinkciju izmeŤu populacija ssp. nigra (Banjska stena, Omar i Zmajevaţki potok) i ostalih ispitivanih podvrsta i varijeteta ove vrste, ali nije bilo moguše meŤusobno razdvojiti ostale ispitivane podvrste i varijetete. Uoţena distribucija mtDNK haplotipova u ispitivanim populacijama crnog bora omogušila je definisanje tri scenarija koji mogu objasniti sadašnju distribuciju mtDNK diverziteta kod crnog bora u Srbiji. Dobijeni rezultati su uporeŤeni sa dostupnim podacima o genetiţkom diverzitetu i diferencijaciji P. nigra populacija. Kljuĉne reĉi: Pinus nigra, Pinaceae, n-alkani, terpeni, hemotaksonomija, jedarna DNK, hloroplastna DNK, mitohondrijalna DNK, genetiţki diverzitet, genetiţka diferencijacija, protok gena Nauĉna oblast: Biologija Uţa nauĉna oblast: Morfologija, fitohemija i sistematika biljaka UDK: [575.832+575.222/.224]:582.475(497.11)(043.3) Determination of variability and differentiation of native populations of Pinus nigra Arnold in Serbia using phytochemical and molecular markers ABSTRACT In this work phytochemical and genetic variability and differentiation of seven native populations belonging to different infraspecific taxa of Pinus nigra (ssp. nigra, var. gocensis, ssp. pallasiana i var. banatica) in Serbia were analyzed. In the needles of 195 trees from seven populations, composition and variability of n-alkanes and terpenes were determined. The size of the n-alkanes found in the needle cuticular waxes of the black pine populations investigated ranged from C to C , with the exception of that of the 16 33 subspecies nigra, which ranged from C to C . The most abundant n-alkanes were the 18 33 four odd-numbered n-alkanes C , C , C , and C (mean contents of 10.3, 16.5, 15.1, 23 25 27 29 and 10.7%, respectively). In the needle essential oils a total of 58 individual components out of the 75 compounds detected could be identified. The major components of the oils were α-pinene (43.6%) i germakrene D (29.8%), comprising together in average 73.4% of the essential oil composition. Multivariate statistical analysis (PCA, CDA, and HCA) of used phytochemical markers showed, in general, a tendency to the formation of three populations groups (nigra, pallasiana, and banatica). Based on the terpene variability, populations Priboj and Goţ, determined as var. gocensis, showed a moderate tendency of separation from the first group (ssp. nigra), while based on n-alkane composition, population Priboj showed even a greater tendency of separation. It was assumed that taxon gocensis might be a transitional form between taxa nigra occurring in the west and pallasiana growing in the southeast of Serbia. We screened 114 trees from seven studied P. nigra populations from Serbia with nuclear (nrDNA), chloroplast (cpDNA) and mitochondrial (mtDNA) markers which have bi-parental, paternal and maternal inheritance, respectively, and different evolutionary rates to infer levels of genetic diversity and structuring within studied area. Due to the lack of nuclear microsatellites (nuSSRs) specifically developed for P. nigra, we employed three EST-SSRs developed for P. taeda for cross-species amplification in P. nigra. Although two EST-SSR loci were successfuly PCR-amplified in our samples, they were invariable and discarded from further analyses. Out of five tested cpDNA SSRs, three were successfuly PCR-amplified in our samples, and 22 alleles were combined into 38 haplotypes. As expected, given the extensive pollen flow in conifers, the levels of cpDNA diversity were high (H = 0.949) and genetic differentiation was low (Fst = 0.017, p = T 0.108, Gst = 0.024, Rst = 0.066). Cluster analyzes based on Bayesian method (STRUCTURE and TESS) instead of genetic distances, also showed that all studied P. nigra populations represent only one genetic group according to the chloroplast genome variability. On the other hand, PCA analysis based on a frequency cpSSR alleles and haplotypes, and NMDS analysis based on the values of genetic differentiation of population pairs showed that populations of ssp. nigra, ssp. pallasiana, and var. banatica can be considered as three separate groups according to the type of variability. The main difference between PCA analysis based on haplotype frequencies and NMDS analysis, on the one hand, and PCA analysis based on allele frequencies, on the other hand, is reflected in the fact that the first two analyzes indicate a different type of variation of population Priboj (var. gocensis). Out of three tested mtDNA loci, only one (nad 7 intron 1) was successfuly PCR-amplified in our samples, and two mtDNA haplotypes were found resulting in relatively low levels of mtDNA diversity (H = 0.357) but moderate genetic T differentiation (Gst = 0.359), a finding concordant with asymetrical gene flow in conifers. Also, on the base of the mtDNA genome, it was possible to distinguish between populations of ssp. nigra (Banjska stena, Omar, and Zmajevaţki potok) and the other studied subspecies and varieties of this species. However, it was not possible to separate the other investigated subspecies and varieties. The observed distribution of the mtDNA haplotypes in these populations of black pine has allowed definition of three scenarios that can explain the current distribution of mtDNA diversity in black pine in Serbia. We discuss our results in relation with available data on genetic diversity and differentiation in this species. Key words: Pinus nigra, Pinaceae, n-alkanes, terpenes, chemotaxonomy, nuclear DNA, chloroplast DNA, mitochondrial DNA, genetic diversity, genetic differentiation, gene flow Scientific field: Biology Specific scientific field: Morphology, phytochemistry and systematics of plants UDK: [575.832+575.222/.224]:582.475(497.11)(043.3) SADRŢAJ 1. UVOD .......................................................................................................................... 1 1.1. Distribucija i taksonomski pregled familije Pinaceae Lindley ............................ 1 1.2. Distribucija i taksonomski pregled roda Pinus L. ................................................ 4 1.3. Pinus nigra J. F. Arnold .......................................................................................... 6 1.3.1. Sistematski poloţaj crnog bora ........................................................................... 6 1.3.2. Poreklo i otkriše crnog bora................................................................................ 6 1.3.3. Morfologija, varijabilnost i taksonomija crnog bora .......................................... 7 1.3.4. Horološke, ekološke i fitocenološke karakteristike crnog bora ........................ 16 1.3.5. Privredni i farmakološki znaţaj crnog bora ...................................................... 21 1.4. Alkani...................................................................................................................... 25 1.4.1. Opšte karakteristike voskova ............................................................................ 25 1.4.2. Opšte karakteristike alkana ............................................................................... 29 1.4.3. Distribucija alkana ............................................................................................ 30 1.4.4. Biosinteza alkana .............................................................................................. 32 1.4.5. Genetska kontrola biosinteze alkana................................................................. 35 1.4.6. Taksonomski znaţaj alkana .............................................................................. 36 1.4.6.1. Niţi nivoi klasifikacije ............................................................................... 37 1.4.6.2. Viši nivoi klasifikacije ............................................................................... 38 1.5. Terpeni.................................................................................................................... 40 1.5.1. Definicija i opšte karakteristike etarskih ulja.................................................... 40 1.5.2. Opšte karakteristike terpena.............................................................................. 42 1.5.2.1. Monoterpeni ............................................................................................... 44 1.5.2.2. Seskviterpeni .............................................................................................. 47 1.5.3. Distribucija i uloga terpena u biljkama ............................................................. 48 1.5.4. Biosinteza terpenskih molekula ........................................................................ 50 1.5.5. Genetska kontrola biosinteze terpena ............................................................... 54 1.5.6. Taksonomski znaţaj.......................................................................................... 56 1.5.6.1. Niţi nivoi klasifikacije ............................................................................... 56 1.5.6.2. Viši nivoi klasifikacije ............................................................................... 58 1.6. Populaciono-genetiĉka i filogeografska istraţivanja kod biljaka ..................... 59 1.6.1. Parametri genetiţkog diverziteta i genetiţke diferencijacije (strukture) izmeŤu više populacija ............................................................................................................ 65