Útmutató a Sejtbiológia tanulásához az Anatómia, Szövet- és Fejlődéstan keretében Az Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet 2010/2011 tanévben elsőéves, ÁOK-s hallgatói számára. Dr. Kálmán Mihály egy. tanár Előszó Az egyetemi Curriculum Bizottság határozata értelmében a Sejtbiológia témakör oktatását a morfológiai vonatkozású anyagrészek esetében az Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet, ill. a Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet, míg a funkcionális anyagrészeket illetően az élettani és biokémiai intézetek veszik át. Az anyag elsajátításához továbbra is rendelkezésre állnak a Biológiai Intézet által készített könyvek-jegyzetek, jelesül • Madarász-Csaba: A sejt szerkezete (Elektronmikroszkópos atlasz) • Darvas-László: Sejtbiológiai Jegyzet (SbJ) • Fülöp: Biológiai Gyakorlatok jegyzet (BGy) továbbá ajánlható • Röhlich Pál: Szövettan általános szövettani része (sok mindent felölel a sejtbiológiából is, de külön nem kapható, csak a részletes szövettani résszel együtt) • Szabó és mtsai: Sejtbiológia, Medicina, Budapest, 2009 (messze többet ad a kötelező anyagnál!). Ezért, és az átálláshoz rendelkezésre álló idő rövidsége miatt is, Intézetünk egyelőre nem adott ki saját jegyzetet az általunk most oktatásra kerülő anyagból. Ehelyett ez a rövid, házi készítésű Útmutatót adjuk. Ebben megjelöljük • mi az, aminek tudása a középiskola elvégzése alapján elvárható; • az egyes témakörökhöz (- az egyes előadások anyagához) mit kell megtanulni a Sejtbiológia jegyzetből; • mik azok az anyagrészek, amelyeket más tantárgyak keretében oktatnak; • hogyan kapcsolódik anyagunk a Szentágothai-Réthelyi Funkcionális Anatómia (továbbiakban: SzR) egyes fejezeteihez; • részletesebben kidolgoztunk néhány témakört, ahol ezt szükségesnek láttuk. Az anyag sorrendje nem a Sejtbiológia jegyzet fejezeteinek sorrendjéhez igazodik, hanem a témából tartott előadások szerint van tagolva (ezek számozása pedig ugyanaz, amelyet a tanmenetben viselnek). Lényeges: amikor valamire azt mondjuk ’nem megtanulandó’ – az csak az Intézetünknél tett számonkérésekre vonatkozik. Más intézetek (Biokémia, Élettan) ezeket oktatni fogják, és számon is kérik. A ’megtanulandóként’ említett anyagrészek esetében a vázlatos rajzokat is reprodukálni kell. Az apró betűs részek csak tájékoztatásul vannak. Kémiai képleteket megtanulni nem kell, de a változások lényegét érteni igen. Mivel előfordulhat, hogy az Útmutató szövegén menet közben is kell változtatni, az esetleges változásokat színes betűvel fogjuk nyomni, és a változtatás időpontját a cím alatt feltüntetjük. 1 Az idevonatkozó előadások címe, és helye az ez évi előadások sorrendjében: 2. Fény- és elektronmikroszkópos hisztotechnika. Immunhisztokémia, in situ hibridizáció, autoradiográfia 3. A sejt membránrendszerei, membrán-recikláció, exo-, endocitózis 4. 2012-ben: az első szöv. gyak. anyaga, ill. egyrésze a Mirigyhám előadásba vonódott.: A sejtorganellumok szerkezete. 5. 2012-ben: 6. ea.: A sejtmag és a kromoszómák 10.2012-ben: 9. ea.: Sejtfelszíni specializációk, sejtkapcsolatok, 17. 2012-ben: 9. és 16. ea.: Sejt-kötőszöveti kapcsolatok, lamina basalis, extracelluláris mátrix. 26.2012-ben: 28. ea.: Mitózis, őssejtek, differenciálódás 31.2012-ben: 34. ea.: Citoszkeleton és sejtmozgás XX. Meiózis, ivarsejtképződés (a második félévben) 2. Fény- és elektronmikroszkópos hisztotechnika A középiskolás tanulmányok alapján elvárt ismeretek: • a fény hullámtermészete, törés, fázis, polarizáció, interferencia, elhajlás fogalmai; • a képalkotás módja a fénymikroszkópban, ill. az elektronmikroszkópban; • a képalkotás elvi határai a fénysugár, ill. az elektronsugár hullámtermészete alapján; • fluoreszcencia, röntgensugárzás. A különböző elveken alapuló mikroszkópok képalkotásának menetét részletesebben a Biofizika tantárgy keretében fogják tanulni, a második félévben. Rövid ismertetést ad BGy 7-9. ill. 24-26. old. A fénymikroszkóp részeinek és használatának gyakorlati oktatására az első szövettani gyakorlaton kerül sor. A) Fénymikroszkópos hisztotechnika Kétféle megközelítést alkalmazhatunk. a) a vizsgált objektumot a mikroszkóp alá helyezve, alulról átvilágítjuk, ezzel belső szerkezetéről kapunk információt; b) felülről világítjuk meg, ezáltal felszíni sajátságait vizsgálhatjuk. Ehhez ma már mindig ún. sztereomikroszkópot használunk (ld. Biofizika), amelynek különleges objektíve van, nem tévesztendő össze a gyakorlatokon is használt binokuláris mikroszkóppal. Az átvilágításos módszernél két feltételnek kell teljesülnie: a) a vizsgált minta legyen olyan vékony, hogy a fény áthatolhasson rajta; b) a vizsgált belső szerkezeti elemek (pl. sejtek, sejtrészek, stb.) színükben vagy fénytörésükben legyenek eléggé különbözőek. A legtöbb sejtnek nincsen, vagy alig van természetes színe (kivételek pl. a vörös vértestek, ill. a pigmentált sejtek), és részeik törésmutatója alig különbözik a vízétől, vagy a környező szövetnedvétől. Ha élő mintát vizsgálunk, a vékonyság feltétele többnyire csak kenetek, sejttenyészetek esetén érvényesül. A sejtek, szövetek pusztulása után pedig szerkezetük felbomlik, nem vizsgálható, bár a kenetek beszárítással tartósíthatók. Festési módszerek élő sejten csak ritkán alkalmazhatók (ilyenek az ún. szupravitális festések, pl. neutrálvörössel, vagy a fagocitózis kimutatása). A struktúrákat elkülöníthetjük fénytörésük minimális különbségeinek felhasználásával (fáziskontraszt-, ill. interferencia mikroszkóp, ld. Biofizika), vagy a polarizált fényre gyakorolt hatásuk alapján (polarizációs mikroszkópia). 2 Polarizáció, kettőstörés, anizotrópia – valamennyinek alapja a struktúra rendezettsége, emiatt gyakran együtt kerülnek szóba, és néha fel is cserélik, vagy szinonimaként emlegetik őket. Részletesebben a Biofizika ill. a Biokémia foglalkozik velük, de röviden célszerű itt is leírni: - Izotrópia és anizotrópia: Valamely közegben valamely fizikai jellemző azonos, ill. nem azonos a tér minden irányában. Az anizotrópia a tér valamely irányában rendezett szerkezetre utal. Leggyakrabban a fénytörés esetében tapasztalható. - Polarizáció: A fénytanban azt jelenti, hogy a fény elektromágneses rezgése egy bizonyos síkba esik. Polarizációt hozhat létre a közönséges üvegen való visszaverődés is, ha a beesési szög megfelelő (tangense 1,5), de jellemző a rendezett struktúrákra is. - Kettőstörés: Akkor lép fel, ha egy anyagban kétféle törésmutató mérhető, a minden irányban azonos ’normális’ fénytörés, és egy csak bizonyos irányban észlelt, az áthaladó fény egy részére (ún. ’rendellenes sugár’) érvényes törésmutató. Tehát tkp. anizotrópia következménye, és szintén rendezett szerkezetre utal. Lehet pozitív vagy negatív, egy- vagy kéttengelyű (részletesebben ld. a fénytan idevonatkozó fejezeteit). Az említett ’rendezett struktúrákra’ a fénytanban általában kristályszerkezeteket hoznak fel például, de így viselkednek a fonalszerű molekulák, ha áramlás hatására (’áramlási kettőstörés’), vagy a szövetekben (izom, kollagénrost) rendeződtek Ahhoz, hogy hosszan eltartható, jól vizsgálható anyagokat kapjunk, a következő műveletekre van szükségünk: fixálás, beágyazás, metszés, festés, fedés. Ld. BGy 10-14. old. is. a) Fixálás a halál utáni lebomlás meggátlására, az eredeti szerkezet megőrzésére. Régebben sokféle, rafinált összetételű fixálót alkalmaztak, fehérjekicsapó nehézfém-vegyületeket (pl. szublimát, ozmiumtetroxid), vízelvonó alkoholt (erősen zsugorít!), stb. Mára szinte egyeduralkodóvá vált az aldehides fixálás. Az aldehidek a fehérjék oldalláncai között keresztkötéseket hoznak létre. Leggyakrabban formaldehidet használnak, vagy ennek poralakú származékát, a paraformaldehidet (természetesen feloldva!). A fixálásnak két útja van: - immerziós: egyszerűen a fixálóoldatba merítjük az anyagot, amelybe diffundál a fixáló. Ilyenkor az anyag közepe lassan fixálódik, bomlást szenvedhet, a kapillárisokat a halál után duzzadó szövetek összenyomják. Emberi anyagot rendszerint így fixálnak. - perfúziós: az állatot igen mélyen elaltatjuk, és a szívébe kötött kanülön át fixálóval töltjük fel. Ez a módszer gyorsabb, és a kapillárisok ürege nyitott marad. b) Beágyazás: minél vékonyabb szeletet akarunk készíteni, annál keményebbé kell tennünk az anyagot. Erre a célra szolgál a beágyazás. A beágyazószerek vízzel nem keverednek, a vizes anyagot nem járják át, ezért az anyagot egyre töményebb alkoholfürdőkben víztelenítjük. Ezután egy ’intermedier’ közegbe tesszük (pl. xilol), amely az alkoholt is, a beágyazószert is oldja. Végül meleg paraffinnal, celloidinnel, vagy újabban paraplaszttal (szintetikus viasz) itatjuk át (infiltráció), amely lehűtve megszilárdul. Beágyazás előtt fontos az anyag orientációja (milyen részét, milyen síkban akarjuk metszeni?). A beágyazott szövetminta a blokk. c) Metszés: acélkéssel, mikrotómmal végezzük. A metszetvastagságot áttéttel állítjuk be, általában 2-10 mikrométer közöttire. A beágyazás hátrányait (időveszteség, alkohol és más szerves oldószerek hatása) fagyasztva metszéssel kerülhetjük ki (pl. ha lipideket akarunk festeni, vagy műtét közbeni szövettani diagnózisra van szükség). Ugyanakkor egyes metszhetetlenül kemény anyagokat (csont, fog) csiszolással vékonyítunk el (igen nehéz eljárás, a csiszolatok ezért ma már igen ritkák és értékesek). A kenetekről már volt szó. Bizonyos esetekben vékony rétegeket lehúzva, azokat kiteregethetjük (nyúzat, ill. kiterített készítmény). 3 d) Festés: Alapja lehet fizikai (zsírfestők), ionos kötés (pl. a bázikus hematoxilin a savakhoz kötődik: ún. ’bazofília’), kovalens kötés (pikrinsav a fehérjékhez), stb (BGy 15-23. old.) A festések lehetnek: • progresszívak vagy regresszívek (más néven felszállók vagy leszállók), utóbbinál előbb ’túlfestünk’, majd a nemkívánatos felesleget kimossuk (differenciálás) • szimultán vagy szukcesszív, aszerint, hogy a festő-anyagokat egyszerre, vagy egymás után alkalmazzuk; • elektív, ill. szelektív, aszerint, hogy egy bizonyos anyagot akarunk feltüntetni, vagy esetleg többet egymás mellett; • direkt vagy indirekt, aszerint, hogy a festék közvetlenül, vagy előkezelés után kötődik; • pozitív vagy negatív, utóbbinál nem a keresett struktúrát festjük, hanem a hátterét; • orto- vagy metakromáziás, aszerint, hogy a festék a saját színére, vagy más színűre fest; • impregnációk: nehézfémsókkal (ezüst, arany, króm) való átitatás után bizonyos struktúrákon a fém kiválik az oldatból, fekete, barna, vagy sárga színt adva nekik. Festés nélkül vizsgálhatjuk az eleve színes struktúrákat (natív készítmények). A hisztokémiai reakciók egy adott anyag színes és nem oldódó termékké alakításán alapulnak. Ilyennek tekinthető pl. a félév során megismertek közül a Schiff-reakció. A festések és a hisztokémiai reakciók között nem lehet éles határt vonni, ld. például a pikrinsavval való fehérje-festést. Az enzimhisztokémiai reakciók esetében az enzim az általunk adott szubsztrátból képez színes, oldhatatlan terméket, ilyet ismernek meg majd a kolinészteráz-reakció esetén (ld. még BGy 35-40. old.). Bizonyos enzimaktivitás ui. a fixálás dacára is megmarad. A sokféle festéssel, azok hatásával a gyakorlatokon ismerkedünk meg A legfontosabb festések fő komponenseit, és hatásuk lényegét ismerni kell. Az BGy-ben leírt metodikák közül a hematoxilin-eozin, May-Grünvald-Giemsa, toluidinkék, krezilibolya, Schiff- és perjódsav-Schiff (PAS) módszereket kell ismerni, a reakciók lényegét értve, de kémiai képletek nélkül. e) Fedés. A metszeteket tárgylemezre terítve, fedőanyaggal (régen főleg kanadabalzsam, ma DePeX) és fedőlemezzel lefedve vizsgáljuk. Fedőanyag nélkül a levegőn beszárad az anyag, és a benne kialakuló sok kis légbuborék erős fényszórása miatt átlátszatlanná, fehéressé válik. Ugyanez történik, ha a fedőlemez nem fed megfelelően. Különleges fénymikroszkópos eljárások Fluoreszcens mikroszkópia és ennek továbbfejlesztett formája, a konfokális mikroszkópia (BGy 45. old.): A fluoreszcencia fizikai lényegét ld. középiskolai tanulmányok, ill. 2. félév, Biofizika. Vagy a természetes fluoreszcenciát használjuk fel, vagy fluoreszcens festékkel festünk. Ez utóbbiakat manapság elsősorban az immunhisztokémiai vizsgálatokban (ld. a 6. előadást, ill. BGy 41-44. old.) használják. A konfokális mikroszkóp egyszerre csak a metszet egy (beállítható) mélységében alkot képet. Immerziós mikroszkópia: Lényege, hogy a vizsgált anyag és az objektív közötti légteret nagy fénytörésű immerziós olajjal töltjük ki. Ez növeli a feloldóképességet (ld. Abbe-képlet, BGy 7. old.). Ezt csak a legnagyobb felbontóképességű, ún. ’immerziós’ lencséknél használjuk, amelyek enélkül nem is adnának használható képet (ún. ’immerziós’ lencsék, vékony fekete gyűrű jelöli őket). Más lencséhez ne használjunk immerziós olajat, mivel még ha nyomokban is marad rajta, a lencsét maszatossá teszi. 4 A sötétlátóteres mikroszkópia (ultramikroszkópia) és az ultraibolya mikroszkópia inkább csak történeti érdekességű. Előbbi azon alapult, hogy sötét látótérbe oldalról fényt engedve, még az elvben láthatatlan kis részecskék is meg-megcsillantak (mint porszemcsék a lámpafényben). Az utóbbi azt használta ki, hogy a fénymikroszkóp feloldásának alsó határa (a kisebb fokú fényelhajlás miatt) csökken a fény hullámhosszának csökkenésével (ld. Abbe-képlet, BGy 7. old.). Az ultraibolya fényt áteresztő kvarclencséket igényel, és a vizsgált struktúra csak fényképezhető (vagy monitorra kivetíthető), közvetlenül nem szemlélhető. Az elektronmikroszkópia nagyrészt kiszorította ezeket az eljárásokat. Érfeltöltés: A szerv ereibe még beágyazás és metszés előtt megfelelő festéket, pl. tust fecskendezünk. Utána vagy metszeteket készítünk, vagy esetleg az erek körüli szöveteket megfelelő anyaggal impregnálva átlátszóvá tesszük (átderítés). Ez utóbbi esetben az érszerkezet sztereomikroszkóppal térben is szemlélhető. A befecskendezés erejének, ill. a festékoldat viszkozitásának változtatásával elérhető, hogy csak artériák, csak vénák, vagy az egész érrendszer látszódjon. Különböző színű festékek alkalmazásával artériák és vénák, vagy különböző erek eloszlási területei elkülöníthetők. Sejtfeltöltés: A sejtbe kapillárissal festékanyagot töltve, ágrendszerét szemléltethetjük (főleg neuronoknál használt), róla számítógépes modellt készíthetünk. Az eljárást élő sejtben alkalmazva kombinálhatjuk az idegsejt jellemző akcióspotenciál-sorozatának ’tüzelési mintájának’ regisztrálásával. Sorozatmetszés esetén számos, egymáshoz hasonló metszetet kapunk, amelyeket különbözőképpen festve, az egyes eljárások hatását összehasonlíthatjuk. Sorozatmetszetek alapján a struktúrák térbeli szerkezetét is rekonstruálhatjuk (ld. BGy 30. old., II/4. ábra). B) Elektronmikroszkópos hisztotechnika Az elektronmikroszkópiában szintén megkülönböztetünk áteső sugárzásban a belső szerkezetet vizsgáló formát (transzmissziós elektronmikroszkópia, TEM BGy 24-26. old.), és a felületet vizsgáló pásztázó (scanning) elektronmikroszkópiát (SEM, BGy 33. old.). Az elektronmikroszkópos hisztotechnika lépései elvben hasonlóak a fénymikroszkópéhoz, de a nagy feloldás miatt a követelmények magasabbak (BGy 27-29. old.). Az elektronok egy fluoreszkáló ernyőn alakítanak ki képet, a vizsgáló tkp. ezt szemléli. Ahová kevesebb elektron jut, ott a kép sötétebb (’elektrondenz’) lesz. a) Fixálás szinte kizárólag perfúzióval és glutáraldehidet is tartalmazó fixálóval történik. Még beágyazás előtt az anyagot ozmiumtetroxiddal utófixáljuk (impregnáljuk), ennek során a lipidekben fémozmium csapódik ki (eredetileg zsírfestőkent használták). Ez részben fokozza a fixáló hatást, részben, mint nehézfém, elektronszóró hatású, így a lipidtartalmú membrán-rétegeknek sötét (elektrondenz) ’színt’ ad. b) Beágyazáshoz igen keményre merevedő, több komponensből összeállított műgyantát (pl. araldit) használunk, amiből igen vékony metszetek is készíthetők. A dehidrálás elve azonos, az ’intermedier’ általában propilénoxid. c) Metszés. A beágyazószer keménysége miatt üveg- sőt, esetleg gyémántkéssel kell metszeni. A metszetvastagság beállítása (az ’előretolás’ két metszés között) általában hőtágulás segítségével történik. 5 Félvékony metszetek. Részben, mivel az üveg- és gyémántkések maguk is kicsik, részben, mivel minél vékonyabb a metszet, annál kisebb is kell hogy legyen (gyűrődés, szakadás veszélye), az elektronmikroszkópos metszetek kicsik, és még egy kis metszetet is soká tart alaposan átvizsgálni. Tehát jól meg kell gondolni, melyik területet vizsgáljuk. Ezért az elektronmikroszkópiára beágyazott anyagból előbb aránylag vastag (1-1,5 mikrométer), de a szokásos fénymikroszkópos metszetnél jóval vékonyabb metszetet készítünk (ld. még BGy 13-14. old.). Általában toluidinkékkel festjük. Ennek alapján döntjük el, az anyagnak melyik részét érdemes tovább metszeni ultravékony metszetekké (a többit lefaragjuk). Az ultravékony metszetek vastagsága 50-100 nanométer. A helyes vastagságot a metszet színe alapján lehet beállítani. A metszeteket kis, köralakú rácsos lemez (gried) tartja meg az elektronmikroszkópban. Rendszerint rézből készül (nem mágnesezhető, így nem tapad a tűhegyes fémcsipeszhez, amellyel megfogják). Mivel a valódi ’rács’ az anyag egy részét kitakarja, ezért használnak ’lyukas’ griedet is, amelynek lyukát vékony hártyával vonják be, erre teszik a metszeteket. d) Kontrasztozás (’festés’): A grieden lévő metszetet további nehézfém-vegyületekkel (általában uranilacetát, ólomcitrát) kezeljük, ami a nukleinsav- ill. fehérjetartalmú struktúrák elektronszórását fokozza, ezzel ’elektrondenzzé’ teszi őket. Különleges eljárások Fagyasztva törés (freeze-fracture), ill. fagyasztva maratás (freeze-etching). A már említett pásztázó mikroszkópiát alkalmazzák úgy is, hogy a hirtelen megfagyasztott mintát törik, vagy a jeget szublimáltatva ’maratják’ (ld. még BGy 32. old.), ilyen módon a membránrendszerek belsejében lévő fehérjerészecskék is jól láthatóvá válnak (ld. majd később, ezek leírásánál). A fagyasztás folyékony nitrogénben történik, 196 °C-on. Az igen alacsony hőmérsékleten való gyors fagyasztásnál az anyagban lévő vízből képződő jégkristályok aprók maradnak, így a sejtstruktúrát kevésbé károsítják. A kontraszt növelése érdekében a törött felszínre nehézfémet (pl. platinát) gőzölögtetnek. Az ilyen anyagon való tájékozódás külön gyakorlatot igényel. Vastag anyag felszínéről nehézfém- és széngőzölögtetés után levonható replikát készítenek. A hisztokémia, enzimhisztokémia, immunhisztokémia módszerei (ld. később) szintén adaptálhatók elektronmikroszkópra. Alapvető feltétel minden esetben az erősen elektrondenz, lehetőleg nehézfémeket tartalmazó végtermék. Az elektronmikroszkópiában is alkalmaznak sorozatmetszést és térbeli rekonstrukciót. Alkalmazható negatív festés is. Finom éreloszlások korróziós készítményei is vizsgálhatók pásztázó mikroszkóppal. Elektronmikroszkópos röntgen-mikroanalízis: Az elektronsugárzás a mintához érve röntgensugárzást is kivált. Ez részben fékeződési röntgensugárzás (mint az orvosi röntgenkészülékben), folyamatos hullámhosszal, részben ún. karakterisztikus röntgensugárzás (ld. Biofizika), amelynek hullámhossz-spektruma függ a vizsgált minta elemeitől. Sajnos, az élő szervezetet alkotó atomok általában túl ’könnyűek’, és a fémionok ki is oldódnak a hisztotechnikai procedúra során. Ezt elkerülendő, a fagyasztva-szárítás, ill. fagyasztva-helyettesítés módszereit alkalmazzák (freeze-drying, freeze-substitution). Gyors fagyasztás után az előbbinél vákuumban szublimáltatják (olvadás nélkül elpárologtatják, hasonló eljárás a liofilezéshez) a jeget, utóbbi esetben a fagyasztott mintát hűtve addig tartják acetonban, amíg abban a jég feloldódik (nem olvad!), és így a víz helyére aceton kerül. Ezután következik az immár víztelenített anyag beágyazása és metszése. Kristályos anyagok szerkezetét az elektronmikroszkópban az elektrondiffrakció segítségével is vizsgálhatjuk. 6 C) Immunhisztokémia, immuncitokémia A középiskolából elvárt alapismeretek: antigén, antitest, immunizálás, immunglobulin, DNS-, RNS-szintézis, bázisszekvencia, fluoreszcencia, fényképezés kémiai folyamatai, izotóp, radioaktivitás, alfa, béta, gamma-részecskék. Idevágó fejezet: BGy III. In situ kimutatási eljárások (35-49. old.). Immunreakció lényege, befolyásolói, fixálás hatása A keresett anyag az antigén szerepét játssza, amely az általunk alkalmazott ellenanyaghoz (antitest, egy immunglobulin típusú vérfehérje) kötődik. Ez a kötődés (mint az immunreakció általában) igen érzékeny és specifikus. Eredetileg fehérjék lokalizációjára alkalmazták, ma már kismolekulájú anyagokat is tudunk vizsgálni. Azok a tényezők, amelyek a fehérjék térszerkezetét változtatják (pl. pH) befolyásolhatják a reakciót. Immunhisztokémiai reakciót végrehajthatunk fixált anyagon is. Ebben az esetben azonban meg kell találni az optimumot, mivel a túl erős fixálás tönkreteheti a fehérjetermészetű antigéneket, a túl gyenge viszont nem őrzi meg eléggé a struktúrát, ill. nem ’tartja helyükön’ a kisebb molekulájú antigéneket (pl. neurotranszmittereket). Epitopok azok a molekularészletek, melyekhez az antitest közvetlenül kötődik. Ugyanazon anyag ellen termelt antitestek nem feltétlenül ugyanahhoz az epitophoz kötődnek. Immunreakció erősítése, vizualizálása fény- és elektronmikroszkópos szinten Az immunreakció terméke csak akkor látható, ha azzá tesszük. Ennek két fő módja van: • fluoreszcens festékkel való jelölés, • színes enzimreakcióval kimutatható enzimmel történő jelölés. Eredetileg az ún. direkt jelölést alkalmazták, azaz az alkalmazott immunanyaghoz közvetlenül kapcsolták a jelölőmolekulát. Később elterjedtek az indirekt jelölések, ahol a keresett anyag elleni jelöletlen antitest (primer antitest, tkp. egy immunglobulin) megkötődése után egy olyan, jelölt antitestet (szekunder antitest) alkalmaztak, amelynek antigénje az immunglobulin, mégpedig éppen azé az állaté, amelyből a primer antitest származik (a használt fajok száma aránylag szűk: egér, patkány, nyúl, kecske, néha ló, szamár, tengerimalac). Ez a módszer egyben fel is erősíti a jelölődést. Az enzimreakció leggyakrabban peroxidáz-reakció, ez az enzim már nyomokban is diaminobenzidin (DAB) és hidrogénperoxid jelenlétében intenzív barna, oldhatatlan reakcióterméket ad (ezen alapul a vérnyomok kimutatása is). Többféle módon is köthető a szekunder antitesthez: • PAP (peroxidáz-antiperoxidáz) – módszer: a peroxidáz ellen termelt immunglobulin, ha megfelelő állatban termeltük, megköti a peroxidázt, és azzal együtt kötődik a primer antitesthez (az immunglobulinoknak általában több kötőhelyük is van). • ABC (avidin-biotin komplex) – módszer: a szekunder szérumot ’biotiniláljuk’ (biotint kapcsolunk hozzá) a peroxidázhoz, vagy más enzimhez úgyszintén. Az avidin nevű fehérje erősen köti a biotin-molekulákat, ezen át a fehérjéket. Az ABC-módszer igen felerősíti a jelzést. Alkalmazhatunk enzimként pl. alkalikus foszfatázt is. 7 Elektronmikroszkópos immunhisztokémia esetén használhatjuk ugyanazt a peroxidáz (DAB) reakciót. Két megoldás is van: • ’Preembedding’: immunreakció a beágyazás és az ultravékony metszetek készítése előtt. • ’Postembedding’: immunreakció az ultravékony metszeteken történik. Ezeknél szebb eredményt adó, de drága és nehéz reakció a szekunder immunglobulin jelölése kolloid méretű aranyszemcsékkel, melyek az arany nagy atomsúlya miatt elektronmikroszkópban jól láthatók. Ezt a technikát szintén ’postembedding’ módon alkalmazzák. Keresztreakció és egyéb álpozitív eredmények Ha a keresett anyag olyan epitopjával reagál az antitest, amely más anyagokban is megvan, a reakció ez utóbbiakat is kimutatja. Hasonló szerkezetű fehérjék esetén nem ritkaság. Ilyenkor más epitophoz kapcsolódó antitestet kell választani. Ugyanakkor a jelenség előnyös is lehet, mivel egy bizonyos fajból származó fehérje ellen termelt antitest gyakran más fajok hasonló fehérjéinek vizsgálatára is alkalmazható. (Azt a jelenséget, hogy egy adott fehérjemolekula tulajdonságai az evolúció során keveset változnak, a fehérje ’konzervativizmusának’ nevezzük). Nem-specifikus kötődés szintén előfordulhat, ilyenkor az ellenanyag nem immun- hanem egyéb kötődéssel rögzül. Endogén anyagok DAB-reakciót adhatnak (peroxidok, citokróm-oxidáz, hemoglobin), vagy avidin-szerűen viselkednek, esetleg fluoreszkálnak. Ezeket blokkolhatjuk, ill. negatív kontrollt alkalmazhatunk, pl. elhagyjuk a primer antitestet, vagy ’kimerítjük’ a keresett antigén hozzáadásával. Ha ekkor is van reakció, azt nem tekinthetjük specifikusnak a keresett anyagra. Pozitív kontrollt akkor alkalmazunk, ha reakciónk eredménytelen: elvégezzük olyan területen is, ahol a keresett anyag biztosan jelen van. Ha ekkor pozitív eredményt kapunk, kudarcunk oka nem metodikai hiba volt. Ekkor az alábbiakhoz folyamodhatunk: Maszkírozás, feltárás Egyes esetekben a keresett epitophoz ellenanyagunk nem tud hozzáférni, pl. más molekularészlet ’takarja’, vagy szerkezetét elváltoztatja (maszkírozás). Ezen segít a ’feltárás’ enzimes emésztéssel, detergenssel, fagyasztással, mikrohullámokkal, stb. (Hasonló ’feltárást’ végeznek szervezetünkben az ’antigén-prezentáló’ sejtek, ld. immunológia.) Az intracellulárisan elhelyezkedő anyagok vizsgálatához rutinszerűen alkalmaznak ilyen eljárásokat. Antitestek előállítása Két útja van: • Poliklonális ellenanyag készítése: az állatot (hogy milyet: ld. följebb) immunizálják a keresett anyag ellen, majd vérsavójából tisztítva-sűrítve kinyerik a megfelelő antitest(ek) aránylag tömény és tiszta oldatát. Ilyenkor a keresett anyag többféle epitopja ellen is termelődik antitest, mindegyik a gazdaállat más-más limfocita-klónjában (a klón jelentése ez esetben: egy bizonyos sejt utódainak összessége), ezért poliklonális. • Monoklonális ellenanyagot szinte mindig egér limfocita-tenyészetéből készítenek, a megfelelő epitop ellen immunglobulint termelő sejtből származó klón tenyésztésével. Az így készült ellenanyagok hatása erősebb, és specifikusabb, viszont inkább fordulhat elő álnegatív reakció. Előállításáról ld. még: BGy 55. old. alján. Kismolekulájú anyagokat gyakran nagyobb molekulájú ’hordozóhoz’ kötnek (adjuváns), így immunogenitásuk megnő (az immunreakciók a nagymolekulájú anyagok eltávolítására alakultak ki.) Más esetben a kismolekulájú anyag képzéséhez nélkülözhetetlen enzim ellen immunizálnak. Mindezen előállítási módok esetén igen fontos a nyert ellenanyag specificitásának alapos ellenőrzése. Gyári készítményeknél ezt a cég megteszi, de néha az utólagos ellenőrzés is szükséges lehet. 8 Kettős, ill. többes jelölés Ha egyszerre két, esetleg több anyagot is akarunk kimutatni egymás mellett, pl. annak igazolására, hogy ugyanazon sejtben, vagy érintkező sejtben fordulnak elő (vagy esetleg éppen azt, hogy nem), akkor úgy kell a primer ellenanyagokat kiválasztani, hogy különböző gazdaállatokból származzanak, a szekunder szérumokat pedig különböző színnel jelölni. Ellenkező esetben, ha mindkét primerhez ugyanazt a szekundert használjuk, mindkettő egyformán jelölődik majd. Nem mindegy, hogy csak egymás melletti, vagy éppen együttes előfordulás (kolokalizáció) kimutatására törekszünk. Ez utóbbinál olyan jelölési módot kell választanunk, hogy az egyik anyag jelölése ne fedje el a másikét. Erre a célra -de általában is a kettős, még inkább a többes jelölésekre- jobb a fluoreszcens reakció. Ha pl. az egyik anyagot vörös, a másikat zöld fluoreszcencia jelöli, a közös előfordulás helyén sárga színt kapunk. A fluoreszcens reakciók értékelésére egyre inkább előtérbe kerül a konfokális mikroszkóp (ld. bővebben BGy, 45. old.), amely a vizsgált mintának csak egy bizonyos mélységében készít egyszerre képet. Ezzel elkerülhető, hogy a különböző mélységben található jelölődések egymásra vetülése kolokalizáció, ill. érintkezés illúzióját keltse. Az immunhisztokémiai ismeretek elsajátításához ajánljuk még a Western blottolásról írottak elolvasását (BGy 67. old), és lényegének megértését-megjegyzését. Lektinek A jelölés eszközei lehetnek a lektinek. Ezek növényi fehérjék, amelyek képesek kapcsolódni egy-egy meghatározott szerkezetű oligoszacharid részlethez (amelyek sűrűn előfordulnak, mint láttuk, a glikokalixban, a sejtek felszínén). A lektineket megfelelően ’láthatóvá téve’ hasonlóan használhatók, mint az immunanyagok. Talán legismertebb a makrofágok jelölése a Griffonia simplicifolia növény lektinjével. Lektinek egyéb célokra is alkalmasak, pl. a bab (Phaseolus vulgaris) lektinje idegrendszeri pályakutatásra. D) In situ hibridizációs hisztokémia A keresett fehérje szintéziséhez szükséges messenger RNS illetve kromoszómális DNS kimutatására alkalmas. Azon az elven alapul, hogy a nukleinsavakhoz hozzá tud kötődni egy vele komplementer szálú nukleinsav (RNS vagy DNS), amit ’próbának’ (’probe’) hívunk, magát a kötést pedig hibridizációnak. Az ´in situ´ szó pedig arra utal, hogy ez a kötődés a szövetből készült metszet felszínén alakul ki, tehát a kimutatott nukleinsav előfordulási helye azonosítható. Kromoszómális eltérések is kimutathatók. Ennek jelentősége a kromoszómális aberrációk (genetikai betegségek, illetve rákos sejtek) diagnosztikájában és evolúciós kutatásokban van. A módszer jóval érzékenyebb az immunhisztokémiánál. Másik előnye, hogy alkalmas egy adott gén kifejeződésének kvantitatív mérésére, a génkifejeződés változásai is követhetők. Hátránya viszont, főleg az idegrendszer vizsgálatakor, hogy vele a sejtek nyúlványai nem láthatóak, mivel a messenger RNS általában a sejttestben marad. A ’próba’ egyszálú RNS vagy DNS. A DNS ’próbákat’, melyek rövidek (20-40 bázispár) szintetizálni lehet, az RNS (400-800bp) próbákat pedig in vitro transzkripcióval lehet előállítani. Ehhez a minta-DNSt az adott gén cDNS-ének (azaz a ténylegesen átírható DNS-szakaszok együttesének) egy megfelelő hosszúságú darabja adja, melyet egy RNS polimeráz helyeket tartalmazó vektorban klónoznak, majd PCR-ral (’polymerase chain reaction’) sokszorosítanak. A gének bázissorrendje ma már adatbankokból kikereshető, és a megfelelő komplementer bázissorrendű lánc minden esetben szintetizálható. A próbák készítésénél vigyázni kell arra, hogy nem mindegy, hogy az eredeti lánc melyik részéhez készítünk komplementert. A nukleinsavak nagyobb változékonyságot mutatnak, mint a rajtuk szintetizálódó fehérjék, egyrészt, mivel több 9 triplet is meghatározhatja ugyanazt az aminosavat, másrészt nem minden aminosav cseréje okoz alapvető változást egy fehérje funkcióiban, ill. antigenitásában. Az ebből származó fajközi, stb. eltérések a kötéserősség rovására mennek. A jelölt DNS vagy RNS próbákat felviszik a metszetek felszínére. A hibridizáció létrejötte után a feleslegben maradt, illetve rossz helyre tapadt próbát mosással távolítják el. A mosás során a sókoncentráció csökkentésével és a hőmérséklet emelésével érik el, hogy csak a teljes hosszában specifikus kötések maradjanak meg. A mosási hőmérséklet nem érheti el a specifikus hibridkötés ’olvadási’ (azaz szétesési) hőmérsékletét, ami a ’próba’ hosszától és minőségétől, a hozzákötődő in situ nukleinsavval való komplementaritás fokától függ. A próbát kétféleképpen szokták láthatóvá tenni. Vagy radioaktív jelölést alkalmaznak fotopapíros és autoradiográfiás előhívással, vagy pedig kémiailag módosított nukleotidokat építenek be a próbába. Utóbbi esetben a módosított nukleotid immunfestéssel mutatható ki. A kétféle detektálási módszer kombinálható is, ezáltal akár egy sejtben is többféle szekvencia mutatható ki, vagyis az egy sejten belüli együttes génkifejeződés is vizsgálható. (Az ’in situ’-ról ld. még Tóth-Hegyesi: Bevezetés a humángenetikába. C) Autoradiográfia Ld. BGy leírását, 46-49. old. Ehhez még annyit tennénk hozzá, hogy jelölő izotópként általában ’lágy’ béta-sugárzó deuteriumot (hidrogénizotóp), vagy 14C izotópot használnak (az alfa túl könnyen nyelődik el, a gamma túl kevéssé). A reakció erőssége a radioaktivitásra érzékeny emulzió vastagságával (azaz: a benne való elnyelődés, reagálás valószínűségével) nő. Mivel a radioaktív izotópot elhagyó részecske bármerre ’indulhat’, az autoradiogrammon megjelenő szemcse nem feltétlen a jelölt anyag felett, hanem távolabb is lehet, minél vastagabb az emulzió, annál inkább. Az értékelésnél ezt figyelembe kell venni. A kémiai, biokémiai vizsgálatokat forradalmasító izotópjelöléses technikát magyar tudós, Hevesi György fedezte fel, aki ezért Nobel-díjat kapott. 10