AUS DER BAKTERIOLOGISCHEN ABTEfLUXG DES RUDOLP·VTRCHOW-KRANKENHAUSES ZU BERLIX ABTEfLUNGSVOUSTEHER: DR. KUR'r' MEYER UNrrERSUOHUNGEN TIBER DIE BRAUOH BARKEI1' DER KOlIPLElIENrrBINDUNGS lIETHODE FUR DIE SERU1IDIAGNOSE DER TUBERKULOSE DES RINDES MIT DEM ANTIGEN VON PRO:F. DR. BESREDKA, INSrrrrUT PASTEUR ZU PARIS INAUGURAL-DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DER VETERINAR-MEDIZINISCHEN DOKTORWURDE DER TIERARZTLICHEN HOCHSCHULE ZU BERLIN VORGELEGT vox ERICH GEORGE PRAKT.TIERARZT AUS REPPEX I. D. XEUMARK BERLIN 1921 Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH 1!J22 Berlin, den 30. Januar1922 Gedruckt mit Genehmigung der Tieriirztlichen Hochschule zu Berlin R.eferent: Geh. Med.-R.at Prof. Dr. Frosch ISBN 978-3-662-22856-2 ISBN 978-3-662-24790-7 (eBook) DOI 10.1007/978-3-662-24790-7 Die Tuberkulose istwohl die am meisten Opfer fordernde Krankheit des Rindes. Durch die wenig eiweifs- und fettreiche Ernahrung und die schlechte Korperpflege wahrend des Krieges ist die Widerstands fahigkeit del' einzelnen Tiere erheblich herabgesetzt worden, so daB es heute nichts Seltenes ist, wenn sogar in kleinen Viehbestanden tuber kulosekranke Rinder vorgefunden werden. Die wahllose Aufzucht auch von Jungtieren, die von tuberkulosen Elterri abstammen, nul' um zu naohst einmal den stark verkleinerten Bestand aufzufiilIen, half del' Verbreitung del' Tuberkulose die Wege offnen. Die Behandlung und Heilungdel'Rindertuberkuloseistein soschwieriges, ja soaussichtsloses Unternehmen, daBdel'Tierarztgezwungenist,immerund immerwieder dem Besitzer die Abschlachtung anzuraten. Es bleibt nul' ubrig, so fruhzeitig wie moglich die Krankheit zu er kennen und die Ausmerzung del' tuberkulosen Tiere zu veranlassen. Die Schwierigkeiten abel', die Krankheit selbst in vorgeschrittenen Fallen zu erkennen, sind so groB, daB die verschiedensten Methoden ausgearbeitet und naehgepruft wurden, um zu einer Fruhdiagnose zu gelangenund mitihrer Hilfe durch rechtzeitige Beseitigungdel'erkrank ten Tiere die Ansteekungsgefahr zu verringern. So wurden die klinischen und bakteriologischen Untersuchungs methoden hauptsaohlich auf die Erkennung del' ojjenen Tuberkulose angewandt. Auf die Feststellung diesel' Formen kommt es besonders an, denn sie sind die Hauptansteckungsquellen ffir gesunde Tiere. Die mikroskopische Untersuchung des Lungenachleimes, des Darminhaltes, des Gebarmutterauaflusses und del' Milch wurdenftir die Diagnose herangezogen. Diesubkutane, kutane, intrakutaneundkonjunktivaleTuberkulinreaktionensind besonderswertvoll fiil'die Erkenmmg del"gosohloasenen Formen der Tuberkulose, E. George: Komplementbindungsmethode fUr die Serumdiagnose usw. 439 jedoch nicht so einwandfrei, daB sie allein zur sioheren Feststellung ausreichen, Sieleistenaberin VerbindungmitanderenMethodenausgezeichnetediagnostisohe Hille. Von serologischenMethoden wurden zunschst die AgglutinationundPrszipi tationauf ihre Brauchbarkeit gepriift, ohne jedoch praktisch verwertbare Ergeb nisse zu liefern. Ferneristdie vonBO'TdetundGengou1) eingefiihrte undvon Wassermannund seinen Schulern-) fiir die klinische Diagnostik nutzbar gemachte Komplement bindungsmethodeinAnwendung gebrachtworden. Sie beruht auf dem Nachweis vonReaktionsstoffen- Antikorpem- im Blutserum, die sichunterderWirkung einesim Korper anwesendenoder vorhandengewesenenAntigens gebildethaben. Die gebildetenAntikorpersind spezifisch,d. h. siegeben nur mit dem homologen Antigen, in dem uns interessierendenFall mitTuberkelbazillen oder deren Stoff wechselprodukten- dem Tuberkulin- die Bindung des Komplements, wahrend mit Seren, die durch andere Bakterien erzeugte Antikorper enthalten, keine Bin dung hervorgerufen wird. Eine Ausnahme von der Spezifitat der tuberkulosen Antikorper bilden allerdings die durch andere saurefeste Bakterien oder deren Stoffwechselprodukte erzeugten Antikorper. So geben Seren, die Antikorper enthalten, die durch die Wirkung des Bacillus tuberculosis entstanden sind, ebenfalls spezifische Bindung mit Tuberkulin, wie Bang undAndersen3) nach wiesen, InderVeterinarmedizinwurde dieKomplementbindungsmethodezurDiagnose der Rindertuberkulose zuerst durch Henneper;und BackS) angewandt, Wahrend erstererfeststellte, daB bisweilengegen das als"Impfstoff"benutzteAntigenAnti· korper nachgewiesen werden konnten, fand letzterer, daB Sera tuberkulosefreier, geringgradig oder hochgradig tuberkuloser Rinder bei der Komplementablenkung das gleiche Verhalten zeigten. Ruppel und Rickmann6) halten auf Grund ihrer eingehenden Versuche die Feststellungvon Antituberkulinbesonderain denFallenfiirwertvollundniitzlich, wennRinderzum ZweckederTauschungbei Einfuhrin Quarantaneanstaltenoder in gerichtlichen Fallen durch wiederholte subkutane Injektionen von Tuberkulin unempfindlichgemacht sind, sodaBdas Tuberkulinin Form der Thermoreaktion als Diagnostikum versagt. Durch die mehrmalige Tuberkulineinspritzung wiirde die Bildung von Antikorpern vermehrt und dann die Komplementbindung um so aussichtsreicher als Hilfsmittel zur Tuberkulosefeststellung zu verwerten sein, Wenn bei hochgradig tuberkulosenTieren dieKomplementbindung bisweilen des wegen versage, weil keine Antikorper im Serum enthalten waren, sei dies ohne groBeBedeutung,dadieseFalleleichtklinischermittelt,werden. Weber und-DieteTlen7) fanden in einer allerdings nur kleinen Versuchsreihe sowohl bei spontantuberkulosen wie bei kiinstlichinfizierten Rindem spezifische Antistoffe, wahrend sie bei normalen Individuen keine Antikorper nachweisen konnten. Ganz vorziigliche Resultate will Hammer8) mit alkoholischen und Aceton extrakten aus tuberkulosenOrganengemischtmit.PerlsuchtalttuberkulinalsAnti. gen erhalten haben. Er untersuchte das Blut von 96 tuberkulosen Rindem und erhielt nurbei 2TiereneinnegativesResultat. DiesebeidennegativenErgebnisse glaubteer auoh noch daduroherklarenzu konnen, daBbei derAufnahmedes ana tomischen Befundes ein kleiner Herd iibersehen sein konnte, Es wiirden also 100% positiv reagiert haben. Durch dieseErgebnissewurdenBierbaum undBerdel9) angeregt, dieMethode Hammers nachzupriifen. Sie verwandten ebenfalls alkoholische und Aceton· extrakte gemischt mit Perlsuchtalttuberkulin, erhielten aber unter 120 unter- 440 E. George: Komplementbindungsmethode fur die Serumdiagnose suchtenRindernnurbei35%positiveResultate.EinepraktischeBedeutungkonnen sie der Hammerschen Methode nicht zuerkennen. Rothe und Bierbaum10) fanden bei Versuchen, bei denen sie experimentell 30-50cernPerlsuchtvollbakterien, die jahrelangim Exsiccatorgetrocknet waren, intravenoseinspritzten,sowohlbeituberkulosenalsbei nichttuberkulosenRindern einen hohen Antikorpergehalt, Bei 16 spontan tuberkulosen Rindern konnten sie niemals einen hoheren Antikorpergehaltfeststellen, wahrendsie andererseits auch im Serum nicht tuber kuloser Tiere eine geringe Menge Antikorper nachweisen konnten. Brickertll) machte Komplementbindungsversuche mit Alttuberkulin. Die Resultate,dieer in einerVersuchsreihe von 29leicht bisstarktuberkulosen Fallen hatte, spricht er als geringwertig an. Wyschelessky12) untersuchte 31Seren tuberkulosefreier und 83tuberkuloser RinderaufKomplementbindung. Erhalt dieseserologischeUntersuchungsmethode zurErkennungeiner aktivenTuberkuloseform des Rindesfur praktischunbrauch bar. AlBAntigen benlitzte er in der Hauptsache Phymatin, 2. Tuberkelbazillen emulsion und 3. eine Losung von Tuberkelbazillen in 2proz. Milcbsaurelosung. Im Gegensatz zu diesen wenig befriedigenden Ergebnissen haben nun neuerdings Hruska und Pfenninger13) tiber sehr gunstige Resultate berichtet,diesie mitder KomplementbindungsmethodebeiVerwendung des Antigensvon Besredka14) erzielten. Diesegiinstigen Resultate lieBen vermuten, daBdasBesredkascheAntigenbesondereVorteileffirdenKom plementbindungsversuchbiete.BeidergroBenWichtigkeiteinerm5glichst genauen Tuberkulosefeststellung schien es wiinschenswert, die Ergeb nisse Hruskas und Pfenningers nachzupriifen. Das Antigen Besredka, das fiir die Versuche notig war, wurdevon Herm Professor Besredkader bakteriologischen Abteilung des Rudolf Virchow-Krankenhauses Berlin zur Verfugung gestellt. - Das Rinderblut wurde auf den SchlachthOfen zu Frankfurt a. O. und Berlin stets von frisch geschlachteten Rindem entnommen. Es konnte in jedem Fall die Autopsie sorgfaltig vor genommen und jeder Irrtum in der Diagnose vermieden werden. Bei den Versuchen wurde sowohl mit wechselnden Mengen Antigen als auch mit wechselnden Mengen Komplement gearbeitet und bei beiden Modifikationen keine nennenswerten Unterschiede in den Reak tionen ermittelt. - In dieser Arbeit wird nur die Versuchsanordnung von Hruska und Pfenninger mit absteigenden Dosen Komplement be schrieben, da lediglich deren vorziigliche Ergebnisse mich bestimmten, eine Nachpriifung der Arbeit vorzunehmen. .Die Sera wurden meist am Tage der Blutentnahme, selten am folgenden Tage untersucht. DieSerumgewinnung stief aufSchwierigkeiten, daauch beiden 24Stun den abgestandenen Blutproben das abzentrifugierte Serum mancher Tiere emeut Gerinnung zeigte, die sich auch nach nochmaligem Zentri fugieren haufig wiederholte. Bei dem lnaktivieren, das durch halbstiin diges Erwarmen im Wasserbad auf 56° vorgenommen wurde, trat in der Halite der Falle noch eine Flockenbildung, offenbar Ausscheidung von Fibrinogenresten ein. der Tuberkulose desRindes mit dem Antigen von Prof. Dr. Besredka. 441 Durch nochmaliges Zentrifugieren wurden dann die Sera klar oder wenigstens flockenfrei erhalten. Als Antigen verwandte ich, wie bereits erwahnt, das von Besredka, welches auf folgende Weise hergestellt wird: Es werden 30tagige humane und bovine Kulturen, die auf der von Besredka14) angegebenen peptonfreien, mit EiweiB und Eigelb in be stimmter Menge vermischten Bouillon gewachsen sind, zusammenge mischtundbei115*sterilisiert..Die FHissigkeit, die.~ichtopalescierend, bacillenlos ist und kein Pepton und Glycerin enthalt, halt Besredka fiir eine Mischung, die allen Forderungen entspricht, die man an ein tuberkulOses Antigen stellen kann. DasAntigen war in zugeschmolzenen Glasphiolen ubersandt worden. Vor Gebrauch wurden die Glaser stark geschiittelt, um eine gleich miiBige Verteilung zu verburgen, zumal sich in einigen Olasern ein ge ringer Bodensatz bemerkbar machte. Als Komplement wurde Meerschweinchenserum, frisch und voll kommen klar zentrifugiert in der Verdiinnung 1 :15 mit isotonischer Kochsalzlosung angewandt. Das hamolytisehe System bestand aus 5proz. Hammelblutkorperchenaufschwemmung, die mit der fur jeden Versuch besonders bestimmten vierfach losenden Dosis eines hamoly tischen Kaninchenserums sensibilisiert war. Die Versuchsanordnung ergibt sich aus folgendem Schema: I I Antigen Besredka Inaktiviertes Rinderserum KompJement 0,15 eern 0,1 cern 0,25 0,15 cern 0,1 eern 0,2 0,15 eern 0,1 cern 0,15 0,1 eern 0,25 0,1 eern 0,2 0,1 ecrn 0,15 0,15 cern 0,25 0,15 ccrn 0,2 0,15 com 0,15 0,15 Alle Rohrchen wurden eine Stunde bei Zimmertemperatur und eine Stunde im Brutschrank bei 370 gehalten. Dann wurde allen Glasern 0,5 ccm Blutkorperchenauischwemrmmg, die eine Viertelstunde zuvor mit der vierfach losenden Do~is sensibilisiert war, zugefiigt und die Reihe wiederum in den Brutschrankgestellt. Da manche Sera die Blut kdrperchon stark agglutinierten, war haufiges Schiitteln erforderlich. NachLosungderKontrollen wurdedas Resultatdes Versuchsabgelesen. Ich habe im ganzen 28 Normalsera und 64 Sera von tuberkulosen Rindern untersucht. Zur Berechnung der Starke der Reaktion habe ich folgende Zeichen gewahlt: 442 E. George: Komplementbindungsmethode fUr die Serumdiagnose 1.VollstandigeHemmungder HamolyseinallendreiGlasern = ++. 2. Hemmung bei 0,15 em Komplement = +. ±. 3. Unvollstandige Hemmung bei 0,15cern = 4. Hamolyse = - . Die tuberkulosen Sera habe ieh wie Hruska und Pfenninger naeh dem Grad der Erkrankung in funf Gruppen eingeteilt. I. Drusentuberkulose, II. Lungen- und Drusentuberkulose. III. Lungen-, Drusen- und Pleuratuberkulose. IV. Lungen-, Drusen-, Pleura-, Peritoneal- und Eingeweidetuber kulose. V. Generalisierte Tuberkulose. Von den28Normalseren waren 18= -, 7 = ±, 1= +,2 = ++. Von diesen zwei voletandig hemmenden wirkte eines sehr stark agglu tinierend auf die Blutkorperchen, so daB hierdureh vielleieht das Aus ± bleiben der Hamolyse bedingt war. Auch eines, das Reaktion zeigte, hatte etwas agglutinierende Wirkung. Von den Fallen der GruppeI habeieh 26 untersucht. Das Ergebnis war: 13= -, 9= ±, 3= + , 1='= + +. Von den 24 Seren der Gruppe II waren: 7=-, ll= ±, 4=+, 2=++. ++ Ein Serum, das cine Reaktion zeigte, agglutinierte sehr stark. Von 5 Seren der Gruppe II reagierten: 2=-, 3= +. Von Gruppe IV wurden ebenfalls 5 Sera gepriift. 3= + , 2=++. Von Gruppe V standen mir vier Sera zur VerfUgung. 1=-, 2=+, 1=++. Sera von Fallen von Miliartuberkulose,die dieGruppeVIvon Hruska und Pfenninger bilden, konnte ich nicht beschaffen. Der Ubersicht wegen seien alle Ergebnisse noch in einer Tabelle zusammengestellt: ± + ++ Gruppe T 13 9 3 1 26 ~ II 7 11 4 2 24 " III 2 0 3 0 5 IV 0 0 3 2 5 V 1 0 2 1 4 Sa. 23 20 15 6 64 der Tuberkulose des Rindes mit dem Antigen von Prof.Dr. Besredka. 443 In Prozenten ausgedruckt ergibt sieh also: Hemmnngen uberhaupt Absolute Hemmungen Normalsera 36,7% 10,8% Gruppe I 50% 15,5% II 70% 25% ., III 60% 60% " IV 100% 100% V 75% 75% Zum Vergleieh seien die Ergebnisse von Hruska und Pfenninger angefUhrt: Hemmungen Normalsera 2,2% Gruppe I 59,4% .. II 84,1% III 94,7% IV 94,4% V 100,0% VI 94,1% Wenn man einen Vergleieh zieht und zunachst die Normalsera ins Auge faBt, so ergibt sieh, daB wir eine grollere Zahl unspezifiseher Reaktionen (10,8%) als jene Autoren (2,2%) haben, wobei wir nur die absoluten Hemmungen berucksichtigen. Andererseits haben bei den tuberkulosen Seren die franzosischen Autoren eine weit grolsere Zahl von positiven Resultaten (84,5%) als ieh (33%). Allerdings habe ich hierbei unvollstandige Hemmungen nicht eingereehnet. Es erscheint auffallig, daB Hruska und Pfenninger unvollstandige Hemmungen, die bei meinem Material sehr haufig vorkamen, gar nicht erwahnen, Es ist moglich, daB sie solehe Reaktionen als positiv ge reehnethaben. Wurde ieh mieh diesem Vorgehen anschliefsen,so wtirde sich allerdings die Zahl der positiven ebenfalls wesentlieh erhohen, aber ieh hatte dann andererseits eine noeh grolsere Zahl unspezifiseher Resultate zu verzeiehnen. Ieh glaube daher, wie dies ja auch sonst bei der Bewertung der Komplementbindungsreaktionen ublich ist, diese unvolletandigen Reaktionen nicht ohne weiteres als positive, sondern nur als zweifelhafte ansehen zu durfen, Urn unsere Differenzen zu erklaren, konnte man vielleieht daran denken, daB das verwendetc Antigen Besredka auf dem Transport ge litten hat. In samtlichen Glasern mit Antigen war jedoch cine gleich maflige, leieht opaleseierende Bcschaffenheit festzustellen. 444 E. George: KomplementbindungsmethodefUrdie Serumdiagnose Hruska und Pfenninger betonen, daB bei nur klinischer Festetellung der Tuberkulose von 257 positiv reagierenden Tieren 145 = 56,4% der tuberkulosen Rilider nicht erkannt worden waren und daB die Kemple mentbindungsmethode somit imstande ist, die Tuberkulinprobe bei Feststellung der Rindertuberkulose zu ersetzen. Wenn ich die Resultate der subcutanen Tuberkulinprobe nach 08tertag16), der nur 13% Fehldiagnosen, und zwar zu gleichen Teilen bei gesunden und tuberkulosen Tieren hatte, mit meinen Ergebnissen bei der Komplementbindung, die bei normalen 10,8%, bei tuberkulosen Rindern 67% betragen, vergleiche, muB ich unbedingt der Tuberkulin probe den Vorrang lassen, weil die Zahl der Fehldiagnosen bei tuber kulosen Rindem eine viel zu hohe ist und die Komplementbindungs methode in der Praxisnicht so bequem ausgefuhrt werden kann wie die Tuberkulinprobe. Vielleicht sind Rinderseren fur die Komplement bindungsmethode uberhaupt wenig geeignet, da sie nicht selten in der Serumkontrolle so stark agglutinieren oder konglutinieren, daB keine Hamolyse auftritt, sondern beim Durchschutteln der Glaser Hemmung vorgetauscht wird. Schluf3folgerungen. 1. Von den 92 untersuchten Rinderseren zeigten 24 starkere Hem mung, 27 sehwaohere Hemmung und 41 Hamolyse. 2. Von den 92 Seren wurde durch exakte Untersuchung bei der Fleischbeschau bei 28 Tieren keine Tuberkulose festgestellt, von den Seren dieser 28 Tiere hemmten 3 stark, 7 unvollstandig, 18 gar nicht. 3. Von den 92 Rinderseren entstammten50Tieren mit Drusen- und Lungentuberkulose. Von diesen zeigten 10 starkere Hemmung, 20 un vollstandige Hemmung und 20 Hamolyse. Vondiesen 20negativen stammten 2 von Tieren mitoffener Lungen tuberkulose. 4.Von92untersuchten Rinderseren waren 14von starktuberkuloaen Tieren der Gruppe III, IV, V. Unterihnen zeigten II Hemmung, wah rend 3 negativ ausfielen. Unvollstandige Hemmungen wurden bei diesen Kategorien nicht beobachtet. 5.Ausden Ergebnissen,dieichmitderKomplementbindungsmethode nach Besredka hatte, ist festzustellen, daB a) die recht oft zu beobachtenden unvollstandigen Hemmungen nicht ohne weiteres auf cine tuberkul6se Infektion schlieBen lassen und daher diagnostisch weder in positivem noch negativem Sinne ver wertbar sind; b) die Seren tuberkulosefreier, gering und hochgradig tuberkuldser Rinder bei der Komplementbindung sowohl Hemmungen wie Hamo-