UNIVERZITA HRADEC KRÁLOVÉ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA HABILITAČNÍ PRÁCE 2018 Ing. Miroslav Lísa, Ph.D. Univerzita Hradec Králové Přírodovědecká fakulta Katedra chemie Využití chromatografie a hmotnostní spektrometrie v lipidomické analýze Ing. Miroslav Lísa, Ph.D. Habilitační práce Obor: Analytická chemie Hradec Králové 2018 1 Prohlašuji, že předloženou habilitační práci jsem vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou citovány. V Hradci Králové, dne 9.4.2018 Ing. Miroslav Lísa, Ph.D. 2 Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat všem kolegům a spolupracovníkům, kteří se podíleli na vzniku publikací tvořících základ mé habilitační práce. Zejména pak bývalým kolegům ze skupiny Hmotnostní spektrometrie na Katedře analytické chemie Univerzity Pardubice, dále všem studentům a zahraničním stážistům, se kterými jsem v průběhu let spolupracoval. Největší poděkování patří mé rodině, dětem a zejména manželce Haně, která je mi po celou mou vědeckou kariéru důležitou oporou. 3 Obsah Seznam zkratek .......................................................................................................................... 5 Úvod ........................................................................................................................................... 6 1 Analýza triacylglycerolů ................................................................................................... 10 1.1 HPLC separace triacylglycerolů ................................................................................ 10 1.2 Kvantitativní analýza triacylglycerolů ....................................................................... 12 1.3 HPLC/MS charakterizace složení průmyslově významných olejů ........................... 14 2 Analýza izomerů triacylglycerolů ..................................................................................... 15 2.1 HPLC/MS analýza izomerů triacylglycerolů ............................................................ 15 2.2 Analýza regioizomerů a chirálních izomerů triacylglycerolů ................................... 17 3 Lipidomická analýza ......................................................................................................... 22 3.1 (U)HPLC/MS analýza celkového lipidového extraktu .............................................. 22 3.2 LC/MS analýza vybraných tříd lipidů ....................................................................... 26 3.3 Kvantitativní lipidomická analýza ............................................................................. 28 4 Lipidomická analýza v klinických studiích ...................................................................... 30 4.1 Postup lipidomické analýzy a zpracování dat ............................................................ 30 4.2 Lipidomická analýza vzorků pacientů s kardiovaskulárním onemocněním .............. 31 4.3 HPLC/MS lipidomická analýza pacientů s nádorem prsu ......................................... 31 4.4 Lipidomická analýza vzorků pacientů s rakovinou ledvin ........................................ 33 5 Souhrn vědecko-pedagogické činnosti autora................................................................... 34 Použitá literatura ...................................................................................................................... 35 Přílohy ...................................................................................................................................... 35 4 Seznam zkratek Ag-HPLC Argentační chromatografie (Argentation Chromatography) APCI Chemická ionizace za atmosférického tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) DB Dvojná vazba (Double Bond) CAD Aerosolový detektor nabitých částic (Charged Aerosol Detector) CN Počet uhlíků (Carbon Number) ECN Ekvivalentní počet uhlíků (Equivalent Carbon Number) ELSD Detektor rozptylu světla (Evaporative Light Scattering Detector) ESI Ionizace elektrosprejem (Electrospray Ionization) FID Plamenově-ionizační detektor (Flame Ionization Detector) GC Plynová chromatografie (Gas Chromatography) HILIC Kapalinová chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-Performance Liquid Chromatography) MALDI Ionizace laserem za účasti matrice (Matrix Assisted Laser Desorption- Ionization) MS Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry) NARP Nevodné systémy s obrácenými fázemi (Non-Aqueous Reversed Phase) NP Normální fáze (Normal Phase) PCA Analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis) RP Obrácené fáze (Reversed Phase) UHPLC Ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie (Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography) UHPSFC Ultravysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie (Ultrahigh- Performance Supercritical Fluid Chromatography) 5 Úvod Cílem lipidomické analýzy je kvalitativní a kvantitativní popis složení lipidů (lipidomu) v organismu, tkáni nebo buňce a sledování jejich interakcí s ostatními lipidy, proteiny a metabolity. Lipidomika je poměrně mladý obor, který byl poprvé definován jako podobor metabolomiky v roce 2003 autory Han a Gross [1]. Tento obor však nabývá rychle na významu, protože lipidy jsou biologicky aktivní látky, které mají celou řadu nezastupitelných rolí v lidském organismu. Představují hlavní zdroj energie, vitamínů rozpustných v tucích a esenciálních mastných kyselin, jsou důležité strukturní komponenty biologických membrán a fungují jako signální molekuly v buněčné komunikaci [2-4]. Nerovnováha lipidů v organismu může mít vliv na vznik a vývoj řady závažných onemocnění, jako jsou obezita, nádorová onemocnění nebo diabetes, proto jsou lipidy v současné době intenzivně studovány jako potenciální biomarkery. Lipidy jsou definovány jako hydrofobní nebo amfipatické malé molekuly, které vznikají alespoň částečně kondenzací thioesterů a/nebo kondenzací isoprenových jednotek [5, 6]. To představuje širokou škálu látek s odlišnou strukturou, které lze rozdělit do 8 základních kategorií na mastné acyly, glycerolipidy, glycerofosfolipidy, sfingolipidy, sacharolipidy, polyketidy, steroly a prenoly (Obrázek 1). Každá z těchto kategorií dále zahrnuje řadu tříd, podtříd a molekul lipidů, které se navzájem liší funkčními skupinami a navázanými acyly s různou délkou řetězců a počtem dvojných vazeb. Jednotlivé molekuly Obrázek 1 Struktury vybraných zástupců 8 základních kategorií lipidů. 6 lipidů se dále mohou lišit typem izomerie, jako je cis-/trans- izomerie dvojných vazeb, poloha dvojných vazeb v acylovém řetězci, lineární/větvené řetězce nebo poloha acylu na glycerolovém skeletu (regioizomery a enantiomery), přičemž každý izomer má jinou biologickou aktivitu v organismu. Přírodní vzorky obsahují stovky až tisíce molekul strukturně odlišných lipidů, které jsou ve vzorku zastoupeny v řádově rozdílných koncentracích, což klade velmi vysoké nároky na používané analytické techniky. Chromatografické separace společně s hmotnostní spektrometrií (MS) jsou dnes nejrozšířenější analytické techniky v lipidomické analýze [7, 8], které díky výraznému instrumentálnímu pokroku v posledních letech umožňují získat stále detailnější a přesnější informace o složení lipidů ve vzorku. Metody lipidomické analýzy mohou být cílené pouze na vybrané a předem známé molekuly lipidů nebo mohou být metody necílené, které se snaží o detailní popis všech lipidů přítomných ve vzorku. V lipidomické analýze se většinou používají dva základní analytické přístupy, a to analýza lipidů založená na chromatografické separaci lipidů a jejich následné MS identifikaci/kvantifikaci a přímá analýza lipidů pomocí MS (někdy nazývaná též shotgun analýza) [7]. Přímá MS lipidomická analýza zahrnuje metody bez separačního kroku. Vzorek lipidů je přímou infúzí zaváděn do iontového zdroje hmotnostního spektrometru, kde jsou všechny lipidy ve vzorku ionizovány najednou. Lipidy jsou identifikovány na základě MS a MS/MS spekter získaných pomocí hmotnostních analyzátorů s vysokou rozlišovací schopností a správností určení hmoty [9-12] nebo častěji pomocí MS/MS skenů založených na charakteristické fragmentaci lipidových tříd měřených pomocí hmotnostních analyzátorů na principu trojitého kvadrupólu [3, 13-15]. Výhodou MS metod je obvykle vyšší prostupnost vzorků a možnost automatizace pro měření rozsáhlých studií v klinické analýze. Nevýhodou těchto metod je obtížná analýza izomerů, izobarických sloučenin a stopových látek ve složitých směsích. Tyto nedostatky nemají metody využívající separační krok před MS detekcí, kde jsou lipidy separovány pomocí vhodného chromatografického módu a identifikovány/kvantifikovány pomocí MS. Díky separaci lipidů je dále potlačen vliv konkurenční ionizace látek v iontovém zdroji, který může být zásadní především pro lipidy s iontovou funkční skupinou. Vysokoúčinná (HPLC) nebo ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC) jsou široce využívané chromatografické techniky v lipidomické analýze. Lipidy mohou být separovány v systémech s obrácenými fázemi (RP) na základě složení acylových řetězců, tzn. délky řetězců a počtu dvojných vazeb [16-20]. Kapalinová chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) umožňuje separaci lipidů do tříd podle 7 jejich polarity a náboje, zatímco lipidy lišící se acylovými řetězci jsou eluovány v jednom chromatografickém píku odpovídajícímu lipidové třídě [21-24]. HILIC neumožňuje separaci méně polárních lipidů, které nejsou na koloně zadržovány a eluují v mrtvém objemu kolony. Nepolární lipidy mohou být separovány v systémech s normálními fázemi (NP) podle jejich polarity [22, 24-26], které ale nejsou vhodné pro separaci polárnějších lipidů kvůli jejich silné retenci. Izomery lipidů jsou většinou analyzovány pomocí speciálních chromatografických systémů po alespoň částečné frakcionaci vzorku na lipidové třídy. Pro separaci regioizomerů se používá argentační chromatografie (Ag-HPLC), která je založena na tvorbě slabých reverzibilních komplexů dvojných vazeb lipidů se stříbrnými ionty ve stacionární fázi [27]. Enantiomery lipidů mohou být analyzovány s použitím chirálních kolon [28]. Pro lipidomickou analýzu lze využít i ultravysokoúčinnou superkritickou fluidní chromatografii (UHPSFC), která zaznamenala v posledních letech výrazný rozvoj díky instrumentálnímu pokroku. UHPSFC umožňuje rychlou separaci polárních i nepolárních tříd lipidů v jedné analýze [29] nebo separaci jednotlivých molekul lipidů podle acylových řetězců [30]. Kvantitativní lipidomická analýza přírodních vzorků představuje náročný úkol vzhledem k vysokému počtu lipidů ve směsi s velkými strukturními rozdíly. Nejčastější způsob kvantitativní analýzy využívá neendogenních lipidů jako interních standardů pro jednotlivé třídy lipidů [7]. Jedná se o interní standardy lipidů s krátkými nebo naopak dlouhými acylovými řetězci, kombinace lichých a sudých acylů v molekule nebo izotopicky značené analogy. Koncentrace jednotlivých lipidů jsou vypočteny vztažením jejich signálu k signálu interního standardu o známé koncentraci, který je přidáván ke vzorku před jeho zpracováním. Toto zjednodušení poskytuje přijatelné kvantitativní výsledky a je široce používáno především pro srovnání koncentrací lipidů ve vzorcích pacientů a zdravých dobrovolníků v rámci klinických studií. Předkládaná habilitační práce se zabývá vývojem a využitím chromatografických a hmotnostně spektrometrických metod pro lipidomickou analýzu široké škály rostlinných, živočišných a biologických vzorků. V práci jsou popsány metody plynové chromatografie (GC), HPLC, UHPLC a UHPSFC s MS detekcí pomocí chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI) a ionizace elektrosprejem (ESI). Metody jsou využity k detailní charakterizaci vybraných tříd lipidů včetně jejich izomerů, pro analýzu celkového lipidového extraktu a pro analýzu klinických vzorků. Habilitační práce je vypracována jako komentář výsledků 29 původních vědeckých prací v mezinárodních vědeckých časopisech, na kterých se autor práce významně podílel plánováním experimentů, experimentální prací, vyhodnocením dat a 8 publikací výsledků. Práce je členěna do 4 základních kapitol. První kapitola je věnována detailní charakterizaci a kvantitativní analýze triacylglycerolů ve více jak 160 průmyslově významných rostlinných olejích a tucích. Jsou zde popsány možnosti separace triacylglycerolů pomocí kapalinové chromatografie, jejich kvantitativní analýza, charakterizace vlastností vzorků a využití statistické analýzy výsledků pro odhalení falšování olejů. Tato část popisuje soubor přiložených prací P1 – P7. Druhá část práce se zabývá vývojem metod pro analýzu izomerů triacylglycerolů, jako jsou polohové izomery dvojných vazeb, cis-/trans- izomery dvojných vazeb, větvení acylového řetězce, regioizomery a enantiomery v rostlinných i živočišných vzorcích (soubor prací P5, P7 – P13). V této části jsou popsány i autorem vyvinuté postupy syntézy standardů regioizomerů a enantiomerů triacylglycerolů pro vývoj analytických metod. Další kapitola je věnována vývoji metod pro necílenou lipidomickou analýzu celkového lipidového extraktu a vybraných důležitých tříd lipidů v biologických vzorcích (soubor prací P14 – P25). V této části jsou popsány vyvinuté HPLC, UHPLC a UHPSFC metody pro HILIC, NP nebo RP separaci celkového lipidového extraktu i vybraných tříd lipidů, retenční chování lipidů v jednotlivých systémech a kvantitativní analýza lipidů. Poslední část práce je věnována aplikaci vyvinutých metod lipidomické analýzy pro analýzu biologických vzorků v rámci klinických studií. Cílem práce je popis vlivu onemocnění na složení lipidomu na základě porovnání vzorků pacientů se zdravými dobrovolníky v rámci klinických studií zaměřených na kardiovaskulární onemocnění a nádorová onemocnění ledvin a prsu (soubor prací P25 – P29). Práce dále obsahuje souhrn vědecko-pedagogické činnosti autora a přiložený soubor prací. 9