o Université de Montréal Étude structure-fonction des transporteurs ABC de Candida albicans impliqués dans la résistance aux agents antifongiques par Christian Gauthier C) Programme de biologie moléculaire Faculté des études supérieures Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l’obtention du grade de Ph.D. en biologie moléculaire Janvier, 2007 o ©, Christian Gauthier, 2007 5Q ÔQ Q G (11’ Université de Montréal Direction desbibliothèques AVIS L’auteur a autorisé l’Université de Montréal à reproduire et diffuser, en totalité ou en partie, pat quelque moyen que ce soit et sur quelque support que ce soit, et exclusivement à des fins non lucratives d’enseignement et de recherche, des copies de ce mémoire ou de cette thèse. L’auteur et les coauteurs le cas échéant conservent la propriété du droit d’auteur et des droits moraux qui protègent ce document. 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In compliance with the Canadian Privacy Act some supporting forms, contact information or signatures may have been removed from the document. While this may affect the document page count, it does flot represent any Ioss of content from the document. 11 Université de Montréal Faculté des études supérieures Cette thèse intitulée: Étude structure-fonction des transporteurs ABC de Candida albicans impliqués dans la résistance aux agents antifongiques présentée par: Christian Gauthier a été évaluée par unjury composé des personnes suivantes: Jean-Claude Labbé, Ph.D. président-rapporteur Martine Raymond, Ph.D. directrice de recherche Mathieu Cellier, Ph.D. membre dujury John W. Hanrahan, Ph.D. examinateur externe Jean Barbeau, Ph.D. représentant du doyen de la F.É.S. 111 C RESUMÉ Chez Candida albicans, une levure pathogène opportuniste, les gènes CDR] et CDR2 codent pour des transporteurs ABC (TP-binding cassette) très similaires formés de deux moitiés contenant chacune un site de liaison à l’ATP (NBD: nucleotide binding domain) suivi de six segments transmembranaires. Leur surexpression cause la résistance aux antifongiques azolés utilisés pour le traitement des candidoses. L’objectif de mon projet est de comprendre les propriétés structurales et fonctionnelles des transporteurs Cdrlp et Cdr2p de C. albicans. Dans un premier volet, j’ai développé un système d’expression qui m’a permis de caractériser les similitudes et différences entre Cdrlp et Cdr2p. Les deux protéines sont correctement exprimées et fonctionnelles chez une souche de Saccharornyces cerevisiae hypersensible aux drogues, tel qu’évalué par immunobuvardage, par des tests de résistance aux antifongiques, ainsi que par un test de transport de la rhodamine, un substrat cytotoxique fluorescent. Des expériences de marquage avec le dérivé photoactivable {‘2I]iodoaryl azido-rhodamine123 (IAARh123) C ont démontré que les deux protéines lient la rhodamine et que cette liaison s’effectue autant par les moitiés N- ou C-terminales de Cdr2p, d’une manière indépendante l’une de l’autre. Cependant, la co-expression des deux moitiés est nécessaire afin de reconstituer un transporteur fonctionnel. J’ai également démontré qu’en présence de composés antifongiques, la molécule immunosuppressive fK520 inhibe la résistance causée par Cdrlp, mais n’affecte pas l’activité de Cdr2p. De plus, l’expression de Cdrlp entraîne une hypersensibilité au FK520, alors que les levures exprimant Cdr2p sont résistantes à ce composé. Dans un deuxième volet, j’ai étudié les propriétés des NBD de Cdr2p. Les transporteurs Cdrp présentent dans le NBD N-terminal (NBD1) une modification surprenante dans un motif essentiel à la liaison et à l’hydrolyse de l’ATP (GX4GCS/T au lieu de GX4GKS/T). Afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de cette substitution, j’ai muté la C191 atypique pour K ou A, K$99 pour C ou A et j’ai construit un double mutant (C191K1K899C). Ces protéines mutantes sont correctement exprimées à la surface C de la cellule et peuvent lier un dérivé photoactivable de l’ATP ([Œ-32P]$-azido-ATP). Alors iv que les mutations C191A et K899A réduisent légèrement la capacité de Cdr2p à lier l’ATP, la mutation CI9ÏK l’augmente clairement. Les niveaux d’activité de ces mutants ont été —- comparés à celui du Cdr2p sauvage dans des tests de résistance aux antifongiques et d’accumulation intracellulaire de rhodamine. Mes résultats indiquent que C191 dans le NBD1 contribue minimalement au transport des antifongiques, alors que l’intégrité du motifdans le NBD2 (K$99) est essentielle au fonctionnement de Cdr2p. Cette constatation est également supportée par les résultats d’un test d’hydrolyse de I’ATP effectué à partir de fractions membranaires enrichies en Cdr2p. Le photomarquage des moitiés N- et C- terminales de Cdr2p révèle également une forte asymétrie des NBD de Cdr2p dans leur capacite a lier le [c&3,P]8-azido-ATP. Mes résultats démontrent que, malgré un haut niveau d’homologie, Cdrlp et Cdr2p présentent d’importantes différences fonctionnelles, suggérant des rôles biologiques distincts. Les NBD de ces transporteurs sont fortement asymétriques et contribuent positivement, mais d’une façon inégale au mécanisme de transport. C Mots clés: Candida albicans. résistance multiple aux antifongiques, transporteur ABC, CDRJ, CDR2, pompe à efflux, domaine de liaison à l’ATP. o V O SUMMARY In the opportunistic yeast pathogen Candida aÏbicans, the CDR] and CDR2 genes encode highly homologous ATP-binding cassette (ABC) transporters which are overexpressed in antifungal-resistant clinical isolates. These transporters are formed by two homologous halves, cach containing an intracellular nucleotide-binding domain (NBD) followed by a rnembrane-associated domain. The objective of my project is to investigate the structural and functional properties ofCdrlp and Cdr2p. In the first part, I developed a heterologous expression system to characterize the similarities and differences between Cdrlp and Cdr2p. Both proteins were properly expressed and functional in a hypersensitive Saccliarornyces cerevisiae strain, as determined by Western blotting, drug susceptibility assays, and efflux ofrhodamine, a fluorescent cytotoxic substratc. I showed that Cdrlp and Cdr2p can bind the photoreactive analogue [1251]iodoaryl-azido-rhodarnine 123 (IAARhY23) and that both halves of Cdr2p can bind rhodarnine independently. However, C co-expression of both halves is necessary to reconstitute a functional transporter. Interestingly, Cdrlp was found to confer hypersusceptibility to FK520, an immunosuppressive agent, whereas Cdr2p conferred resistance to this compound, uncovering a major functional difference between the two transporters. furthermore, when administered in combination with antifungal drugs, FK520 sensitized celis expressing Cdrlp but flot those expressing Cdr2p. FinaÏly, we showed that Cdr2p confers hypersusceptibility to hydrogen peroxide and resistance to diamide, while Cdrlp has no effect against these oxidative agents. The second part of my project consisted of studying the properties of the Cdr2p NBDs. The Cdrp transporters have a surprising modification in the Walker A motif of the N-terminal NBD (NBD1; GX4GC$/T instead of G)ÇGKS/T). The highly conserved lysine residue is known to be important for ATP interaction. To determine the functional consequences of this substitution, I mutated the atypical Cl91 to K or A, the conserved K899 to C or A, and I also constructed a double mutant (CÏ91KIK$99C). The mutants were correctly expressed at the celi surface and could bind the ATP analog [Œ-32P]8-azido- vi ATP. While the CT9YA and K$99A mutations sÏightly reduced ATP binding, the C191K mutation clearly increased ATP binding by the Cdr2p NBD1. The activity levels of these mutants were compared to the wild-type protein in antifungal resistance assays and intracellular accumulation of rhodamine. My resuits indicate that C191 of NBD1 contributes minimally to antifungal transport, while the integrity of the Walker A motifin NBD2 (K899) is essential to Cdr2p function. This observation is also supported by ATP hydrolysis measurement with Cdr2p-enriched membrane fractions. Photolabeling ofthe N and C- halves also revealed important differences in [Œ-32PJ8-azido-ATP binding, which underline structural and functional asymmetry between the Cdr2p NBDs. My resuits have shown that despite a high level of homology, Cdrlp and Cdr2p possess important functional differences, thus suggesting distinct biological roles. The NBD domains of these transporters are highly asymmetric and contnbute positively, but unequally to the transport process. C Key words: Candida aibicans, antifungal resistance, ABC transporter, CDRJ, CDR2, multidrug efflux pump, ATP binding. o vii TABLE DES MATIÈRES Page titre Présentation dujury ii Résumé iii Summary y Table des matières vii Liste des tableaux xi Liste des figures xii Liste des abréviations xiv Remerciements xvi Dédicace xvii Chapitre 1: Introduction Ç I. LA LEVURE (‘ANDIDA ALBICANS, LES CANDIDOSES ET LEURS TRAITEMENTS 2 A. INTRODUCTION AUX CHAMPIGNONS, LEVURES ET MOISISSURES 2 Ï. Biologie et cÏassfication 2 2. Écologie et utilisations 3 B. LES INFECTIONS FONGIQUES CHEZ L’HUMAIN 5 1. L ‘épidémiologie des infectionsfongiques 5 2. Les mycètespathogènes et les d/je’rentesformes de mycoses 6 3. C’andida albicans 9 4. Lespathologies associées aux candidoses 13 a. Les candidoses mucocutanées 13 b. Les candidoses invasives 15 c. Les autres formes de candidoses 16 C. LEs TRAITEMENTS ANTIFONGIQUES 17 J. Les médicaments antifongiques et leurs modes d‘action 18 a. Médicaments qui affectent la synthèse de l’ergostérol 18 b. Médicaments qui perturbent lamembrane plasmique 24 c. Médicaments qui affectent la synthèse du glucane 26 d. Médicaments qui affectent la synthèse de l’ADN et l’ARN 26 viii e. Autres médicaments antifongiques 27 2. Les échecs des thérapies anttfongiques 27 D. LES MECANISMES DE RESISTANCE AUXAGENTS ANTIFONGIQUES 28 1. Definitions de la résistance 28 a. Résistance clinique versus résistance microbienne 2$ b. Résistance primaire versus résistance secondaire 28 c. Méthodes de quantification de la résistance aux antifongiques 30 2. Les mécanismes de résistance aux agents antifongiques chez C. albicans 32 a. Principes généraux 32 b. Résistance aux azoles et autres inhibiteurs de la synthèse de l’ergostérol 34 c. Résistance aux polyènes 3$ d. Résistance à la flucytosine 38 e. Résistance aux échinocandines 39 3. Laformation de biofiÏrnpar C. albicans 40 4. L ‘impact clinique de la résistance aux azotes 4] II. LES TRANSPORTEURS DE TYPE ABC (ATP-BINDING CASSETTE) ET LEUR RÔLE DANS LA RÉSISTANCE AUX MÉDICAMENTS 42 A. CARAcTERISTIQuE5 STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DES TRANSPORTEURS ABC 42 1. La superfamille des transporteursABC et leurs rôles biologiques 42 2. La structure des transporteursABC 47 a. Structure des NBD et des TMD 47 b. Structure des transporteurs ABC complets 55 3. Les modèles de cycles catalytiques des transporteursABC 57 B. L’IMPLICATIoN DES TRANSPORTEURS ABC DANS LA RESISTANCE MULTIPLE AUX MEDICAMENTS 63 J. La résistance muÏtzle aux médicaments citez les cellules cancéreuses 63 2. L‘étude de la résistancepléïotropique aux drogites (PDR, chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiœ 65 3. Le réseau FDR/CDR chez C. albicans 71 C. LEs TRANSPORTEURS CDR DE C. ALBIcANS 74 1. L ‘identification et la caractérisation des gènes CDR 75 2. La caractérisationfonctionnelle des transporteurs CDR 80 III. LES OBJECTIFS DE MON PROJET 83 o