UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE CATALUNYA Laboratori de Toxicologia Ambiental Intexter Centre de Recerca i Innovació en Toxicologia (CRIT) Comparative study of in vitro cell based assays versus in vivo toxicity tests to monitor environmental hazard of pesticides Memòria presentada per a optar al grau de Doctor per la UPC dintre del programa: Enginyeria de Projectes: Medi Ambient, Qualitat, Seguretat i Comunicació. Presentada: Mª Pilar Alañón Ribas Dirigida per: Dra. Mª Carme Riva Juan Directora del Laboratori de Toxicologia Ambiental del Intexter, UPC Directora del Centre de Recerca i Innovació en Toxicologia (CRIT) Centre de suport a la Innovació Tecnològica. Xarxa IT del CIDEM Terrassa, 2006 2 El present treball d’investigació recollit en aquesta memòria ha estat realitzat per Mª Pilar Alañón Ribas, per a optar al Grau de Doctor per la Universitat Politècnica de Catalunya (UPC) dintre del programa: Enginyeria de Projectes: Medi Ambient, Qualitat, Seguretat i Comunicació. Aquesta tesi doctoral ha estat realitzada al Laboratori de Toxicologia Ambiental (Intexter) de la Universitat Politècnica de Catalunya sota la direcció de la Dra. Mª Carme Riva Juan. Cal remarcar que una petita part del treball de recerca s’ha portat a terme a la Facultat de Veterinària de la Universitat de Milan, Itàlia, vinculada a un projecte conjunt de recerca de les dues entitats. Així mateix s’ha de fer constar que Mª Pilar Alañón Ribas, ha gaudit d’una beca atorgada pel propi laboratori durant tot el temps necessari per tal de portar a terme la present tesi doctoral. Terrassa, Juliol 2006 Dra. Mª Carme Riva Juan Directora de la Tesi doctoral Als meus pares i la meva àvia A les meves germanes Al meu estimat Israel AGRAÏMENTS En primer lloc voldria agrair especialment a la Dra. Mª Carmen Riva, directora del Laboratori de Toxicologia Ambiental, per haver-me acceptat sota la seva direcció al Laboratori de Toxicologia Ambiental de la UPC i donar-me la oportunitat de desenvolupar aquesta tesi. Gràcies sobre tot pel seu interès, ajuda i consells i pel seguiment d’aquest treball durant aquest anys. Agraeixo també el suport econòmic dels projectes REN2003-06917-C02-02 i CGL2004-03514 així com també l’ajut concedit pel MEC, SB2003-0268 que ha permès la col·laboració amb la Facultat de Veterinària de la Universitat de Milan, Itàlia. A la Dra. Simona Stacchezzini per ensenyar-me a treballar amb cultius primaris de granulosa bovina, pels seus útils consells sobre la ciència i sobre la vida. Gràcies també a la Dra. Francesca Caloni per la seva participació en aquest treball. També voldria agrair a l’escorxador de Sabadell per la seva col·laboració en la presa de mostres d’ovaris bovins. Gràcies al Dr. Carlos Barata, de qui he après molt del món de la ciència, al Dr. Demetrio Ráldua per les seves valuoses aportacions a aquest treball i al Dr. Joan Ribó per haver ampliat els meus coneixements especialment del assaig Microtox. Gràcies a la Dra. Argelia Castaño per permetre’m realitzar la estada al Laboratori del CISA-INIA a Madrid i ensenyar-me les proves de citotoxicitat amb línies de peix. Moltes gràcies també a tot el seu equip, en especial a la Dra. Mª Teresa Llorente pel seu suport i disponibilitat durant la realització de la meva estada. Molt especialment als meus companys de laboratori, al Dr. David López per ensenyar- me les tècniques bàsiques del cultiu de línies cel·lulars, a la Dra. Bettina Vallés per ensenyar-me els assaigs amb algues i peixos i en especial pels seus viatges en cotxe Terrassa-Barcelona, a la Joana Damaso per compartir amb mi els seus coneixements sobre biomarcadors, a la Esther Pérez per amenitzar les eternes hores compartides al transport públic, a l’Anna Cornellas per transmitir-me la seva alegria per la vida, a la Ana María, al Dr. Carles Gibert, a la Dra. Minerva García, a l’Esteban, Silvia Ribó, Laura, Anna Navarro i a tots els altres companys amb els quals he coincidit durant aquest anys al laboratori. Gràcies també als amics pels ànims que sempre m’han donat i per les bones estones compartides i sobretot per escoltar-me. Esteu tots en aquest parell de línies. He d’agrair especialment a En Joseba per ajudar-me amb els seus fantàstics coneixements. A la meva família i en especial als meus pares, pel seu recolzament, valentia i esforç perquè pogués realitzar els meus estudis universitaris lluny de casa, tot i sabent que seria molt temps fora de s’ illa. Sense ells mai hagués arribat fins aquí. Gràcies també a les meves germanes, a Na Marta per la seva inestimable ajuda i a Na Nieves per donar-me ànims en les seves llargues converses telefòniques i gràcies a la meva àvia Francisca per confiar sempre en mi. Moltes gràcies també a Na Isabel, En Vicent i especialment a En Toni per la seva ajuda en les impresions. I sobretot, al Israel, per la seva “infinita” paciència, la seva gran ajuda i especialment per estar al meu costat durant aquests darrers mesos. Moltes gràcies a tothom!! Lo que hacemos es como una gota de agua en el océano pero sin esa gota de agua el océano estaría vacío. Teresa de Calcuta IInnddeexx 0. ABSTRACT 1 0.1 Abstract 1 0.2 Resum 3 0.3 Resumen 5 1. INTRODUCTION 7 1.1 Concept of ecotoxicology 7 1.2 Pesticides 8 1.2.1 Classification of pesticides 9 1.2.2 Carbofuran 15 1.2.3 Chlorpyrifos 19 1.3 In vitro methods 26 1.3.1 Alternative methods to animal experimentation 26 1.3.2 The use of cells cultures 26 1.3.3 Primary cell cultures vs established cell lines 29 1.4 In vivo methods 33 1.4.1 Vertebrates. The use of fishes 33 1.4.2 The use of microalgae 35 1.4.3 The use of bacteria 36 1.5 Biomarkers 37 1.5.1 Biotransformation enzymes 39 1.5.2 Oxidative stress parameters 39 1.5.3 Biotransformation products 39 1.5.4 Haematological parameters 40 1.5.5 Immunological parameters 40 1.5.6 Reproductive and endocrine parameters 41 1.5.7 Genotoxic parameters 42 1.5.7.1 Comet assay 42 1.5.8 Neuromuscular parameters 43 1.5.8.1 Inhibition of Acetylcholinesterase (AChE) 44 1.5.9 Physiological, histological and morphological parameters 48 2. EXPERIMENTAL DESIGN 49 2.1 Objectives 50 3. MATERIALS AND METHODS 52 3.1 Pesticides 52 3.1.1 Concepts for predicting multiple mixture toxicity 52 3.1.2 Calculating concentration adition 53 I IInnddeexx 3.2 In vitro assays 55 3.2.1 Fish cell line RTG-2 55 3.2.1.1 Cell culture 55 3.2.1.2 Exposure conditions 55 3.2.2 Bovine Granulosa cells 57 3.2.2.1 Granulosa cell collection 57 3.2.2.2 Granulosa cell culture 59 3.2.2.3 Exposure conditions 59 3.2.3 Cytotoxicity assays 60 3.2.3.1 Highest tolerated dose (HTD) 60 3.2.3.2 Neutral red uptake and Kenacid blue assays 60 3.2.3.3 ATP determination 62 3.2.3.4 Cytotoxicity index 62 3.2.3.5 Statistics 63 3.2.4 Stainig of Acetylcholinesterase (AchE) activity 64 3.2.5 Acetylcholinesterase assay 64 3.2.5.1 Characterisation of the enzyme 64 3.2.5.2 Cell culture and treatment 65 3.2.5.3 Acetylcholinesterase determination 65 3.2.5.4 Protein determination 66 3.2.5.5. Statistics 66 3.2.6 Genotoxicity. Comet assay 67 3.2.6.1 Exposure of cells to pesticides 67 3.2.6.2 Comet assay 67 3.2.6.3 Qualitative analysis 68 3.2.7 Aromatase activity 69 3.2.7.1 Progesterone (P4) determination 69 3.2.7.2 Statistics 69 3.3 In vivo assays 70 3.3.1 Fish. Danio rerio 70 3.3.1.1 Acute toxicity assay. Mortality 70 3.3.1.2. Acetylcholinesterase assay 72 3.3.1.2.1. Tissue preparation 72 3.3.1.2.2. Characterisation of the enzyme 72 3.3.1.2.3 Acetylcholinesterase determination 73 3.3.1.2.4 Statistics 74 3.3.2 Microalgae 75 3.3.2.1 Growth inhibition of microalgae 75 3.3.2.2 Nutrient medium 76 3.3.2.3 Test methods 76 3.3.2.4 Statistics 77 3.3.3 Bacteria. Vibrio fischeri 78 3.3.3.1. Bioluminiscence inhibition 78 II