Universitat Jaume I Departament de Ciències Experimentals Química Analítica Institut Universitari de Plaguicides i Aigües POTENCIAL DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS CON ANALIZADORES DE TRIPLE CUADRUPOLO Y DE TIEMPO DE VUELO PARA LA ELUCIDACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y CONFIRMACIÓN DE PLAGUICIDAS Y PRODUCTOS DE TRANSFORMACIÓN EN MUESTRAS AMBIENTALES Tesis Doctoral MARÍA IBÁÑEZ MARTÍNEZ 2007 Dr. Félix Hernández Hernández, Catedrático de Química Analítica, y Dr. Juan Vicente Sancho Llopis, profesor Titular de Química Analítica, de la Universitat Jaume I de Castellón, Certifican que: la Tesis Doctoral “Potencial de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con analizadores de triple cuadrupolo y de tiempo de vuelo para la elucidación, cuantificación y confirmación de plaguicidas y productos de transformación en muestras ambientales” ha sido desarrollada bajo su dirección, en el área de Química Analítica del Departamento de Ciències Experimentals de la Universitat Jaume I de Castelló, por María Ibáñez Martínez. Tras la creación del Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas (IUPA) por Decreto 260/2004, de 19 de Noviembre, la parte experimental de la Tesis Doctoral se finalizó en las instalaciones del mencionado instituto. Lo que certificamos para los efectos oportunos en Castellón de la Plana, a 15 de Noviembre de 2006 Fdo. Dr. Félix Hernández Hernández Fdo. Dr. Juan Vicente Sancho Llopis Este trabajo responde al compromiso adquirido con la Conselleria de Empresa, Universitat i Ciència de la Comunitat Valenciana por la concesión de una beca predoctoral para la Formación de Personal Investigador (FPI), desde el 15 de Julio de 2002. María Ibáñez Martínez ha sido beneficiaria de una beca Bancaixa concedida por la Universitat Jaume I, para la realización de una estancia en el Industrial Marketing Group del Mass Spectrometry Technologies Centre (Waters-Micromass Corporation) en Manchester, llevada a cabo desde el 3 de Mayo al 3 de Agosto de 2005. El trabajo de investigación llevó por título: “Rapid screening of drinking water for multiple pesticide residue by UPLC-TOF MS” bajo la dirección de Ramesh Rao, Gordon Kearney y Daniel McMillan, y permitió ampliar los conocimientos de la doctoranda en el análisis de contaminantes orgánicos en aguas mediante una técnica tan novedosa como la cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) acoplada a la espectrometría de masas con analizadores de tiempo de vuelo de nueva generación (TOF MS). Fruto de este trabajo se presentaron tres comunicaciones orales en el American Society of Mass Spectrometry, Waters User Meeting celebrado en San Antonio (Texas), en el 1st International Workshop on Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for screening and trace level quantitation in environmental and food samples celebrado en Barcelona, ambos en Junio del 2005. Además se presentó un póster en el Florida Pesticide Residue Workshop celebrado en Julio del mismo año. Finalmente los resultados de este trabajo fueron también presentados en Waters Food Safety Summits, una serie de congresos en el campo de la salud alimentaria, celebrados en París, India, China y Tailandia durante los meses de Septiembre y Octubre del 2005, y en el European Pesticide Residue Workshop (Corfu, 2006). Por otra parte, se realizó una estancia de dos semanas en el Pharmaceutical Marketing Group del mismo centro bajo la supervisión de Jose Castro Pérez, que permitió ampliar los conocimientos de la doctoranda en la realización de experiencias de metabolismo in vivo e in vitro y posterior tratamiento de los datos obtenidos. Fruto de este trabajo se presentó una comunicación en el 13th North American International Society of Study for Xeniobotics/20th Japanese Society of Study for Xeniobotics Meeting celebrado en Maui (Hawai), en Octubre del año 2005. Los trabajos realizados en la presente Memoria han sido en parte financiados por los proyectos del Ministerio de Ciencia y Tecnología “Aplicación del acoplamiento cromatografía líquida- espectrometría de masas (LC-MS/MS y LC-QTOF MS) a la identificación de metabolitos de plaguicidas en muestras de interés ambiental y toxicológico” (Ref: BQU2003-02685) y “Aprovechamiento de nuevos avances en instrumentación analítica para la realización de estudios sobre el impacto de residuos de plaguicidas en la calidad de las aguas subterráneas” (REN2002-01818). Esta Tesis ha sido realizada, y consecuentemente será defendida para la obtención del título de Doctorado Europeo. Previamente a la defensa de la Tesis Doctoral, este trabajo ha sido evaluado por tres censores extranjeros independientes, Prof. Michel W. F. Nielen (Institute of Food Safety, Wageningen, Netherlands), Prof. Janna Hajšlová (Department of Food Chemistry and Analysis, Institute of Chemical Technology, Prague) y Prof. Susan Richardson (National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, USA). Aquesta és una bona oportunitat per poder agrair a molta gent el seu suport, ja que si aquesta Tesi ha arribat a la seua fi és resultat, entre altres coses, de l’ajuda i col—laboració de molts. Començant pel principi vull donar les gràcies als directors d’aquesta Tesi: a Félix per l’ oportunitat que em va donar de formar part d’aquest grup d’investigació i apropiar- me del QTOF així com per tot el temps que m’ha dedicat; a Juanvi, no sols per tutoritzar-me, sinò també per saber escoltar-me, per la seua paciència i per tants moments compartits. Gràcies als dos per fer possible que aquesta Tesi haja tingut un principi i un acabament. També a tots els professors de l’àrea, sempre disposats a ajudar: Paco, Ximo, Toni, Roque i Elena. Gràcies per tot. I als meus companys, ara ja amics: A Óscar (el nostre 112, sempre disposat a sol—lucionar qualsevol problema en qualsevol moment les 24 hores del dia), Carlos, Mercedes, Tania, Cru, Jose, Ángel, Susana, Cecilia, Arantxa, Elena S., Sonia E., Miguel Ángel, Sandra, Carmen i Mª Carmen. Als nostres últims fitxatges: Edu, Jaime, Jose i Ramón. A tots els que han treballat en el grup d’investigació en alguna etapa d’aquesta Tesi: Sonia F., Alicia, Ángela, Tati, Ana, Robert, Luna, Oihana, Mireia. A tots ells, agrair-los les paraules d’ànim i disponibilitat d’ajuda, així com la seua amistad i alegria. Vull agrair també a Cristian, Lourdes, Cristina, Laura i a tota la gent del SCIC la seua col—laboració, així com l’interés d’altres companys universitaris de diferents departaments. Thanks to Ramesh Rao for allowing me to be one more of his investigation group. Thanks to my fellow co-workers from Waters in Manchester (Tim, Gordon, Peter, Keith, Jose, Audrey) for their kindness and patience, and especially to Dan, for devoting part of his time to me and teaching me how to use the UPLC. Thanks to Lorraine MacIntosh for her corrections and comments. Gràcies també a Mª José Lechón (Hospital La Fe, València), a Marta Miquel i Carlos Aragó (Departament de Psicobiologia de la Universitat Jaume I), a Ignacio Morell (Departament d’ Hidrogeoquímica de la Universitat Jaume I) per la seua ajuda tècnica en alguna de les ètapes d’aquest treball. I per últim, a la meua familia i amics: als meus pares, per estar sempre ahí, pel seus ànims i consells a tota hora; al meu germà, per tota la seua ajuda infomàtica (es que me passen unes coses...); als meus cosins i tios pels seus ànims; als xiquets de la casa, Oscar, Andrea, Aleix, Iciar per ajudar-me a desconectar i alegrar-me tots els momentets que passem junts. I como no al meu xiquet, Rubén, pel seu suport incondicional. Gràcies per fer-me somriure! A tots vosaltres, i a algú més que segur se m’oblida, moltíssimes gràcies María Resumen Dentro de la problemática ambiental, los plaguicidas son, posiblemente, una de las familias de contaminantes que más preocupan en la actualidad, debido a su toxicidad y elevado uso en todo el planeta, así como a la posibilidad de contaminación de distintos tipos de muestras (suelos, aguas, aire, productos alimenticios). El elevado número de plaguicidas actualmente en uso, junto con la gran variabilidad que presentan en cuanto a sus propiedades físico-químicas, dificulta de forma considerable su análisis a nivel de residuos. Aunque se han realizado numerosos estudios ambientales, la mayoría de programas de control de estos contaminantes, tanto en el medio ambiente, como en alimentos o seres vivos expuestos, se centran en tan sólo unos pocos productos (normalmente el plaguicida inalterado), a pesar de que se conocen algunos productos de transformación/metabolitos relativamente estables, persistentes y tóxicos. Esta carencia de información generalizada sobre la presencia de productos de transformación (TPs) en el medio ambiente es debida, principalmente, a la falta de metodología analítica. Así pues, parece necesario generar información sobre las rutas de degradación/transformación de estos compuestos, desarrollar metodología analítica que permita determinar sus niveles en el medio ambiente, así como evaluar su impacto en el mismo, especialmente en aguas superficiales y subterráneas. Para este fin, es necesario utilizar técnicas modernas y poderosas, en especial la espectrometría de masas, que en los últimos años se ha mostrado como una técnica indispensable en muchas áreas de la Química Analítica. En esta Tesis se ha explorado el potencial analítico y las aplicaciones del acoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) e híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de plaguicidas, principalmente en el campo medioambiental, poniendo especial énfasis en los aspectos cualitativos, es decir, en la correcta confirmación de la identidad de los compuestos detectados, siguiendo los criterios de las actuales guías europeas. El trabajo ha sido estructurado en cuatro partes. En primer lugar, se ha explorado el potencial del acoplamiento LC-QTOF MS en el análisis cualitativo. La versatilidad de la LC, junto con la elevada exactitud de masa del QTOF y la posibilidad de obtener espectros de iones producto con masa exacta, ha permitido la detección, identificación y elucidación de TPs/metabolitos de plaguicidas seleccionados. Inicialmente, se seleccionó como caso de estudio una familia de herbicidas ampliamente utilizada (triazinas). En vista del éxito de los resultados obtenidos, se decidió ampliar el trabajo a otros plaguicidas aplicados en la Comunidad Valenciana, como por ejemplo, bromacilo, diuron o diazinon. En el caso del diazinon, además, se llevaron a cabo estudios in vitro (con microsomas hepáticos humanos) e in vivo (con ratas), con el fin de elucidar sus principales metabolitos, demostrando así la gran capacidad analítica de esta técnica tanto en el campo ambiental como biológico. Adicionalmente, la metodología desarrollada fue ligeramente modificada para el estudio de compuestos desconocidos (non-target), tras la inyección directa de muestras acuosas de diferentes orígenes. La aplicación de esta metodología permitió la identificación de varios contaminantes en muestras de agua de la Comunidad Valenciana. En segundo lugar, se ha estudiado el potencial del acoplamiento LC-QqQ MS para la determinación cuantitativa de residuos de plaguicidas y de sus TPs en muestras ambientales. Se han puesto a punto dos métodos basados en SPE-LC-MS/MS: el primero de ellos para la determinación multirresiduo de plaguicidas seleccionados y de sus TPs en muestras de agua, y el segundo para la determinación de compuestos altamente polares como el glifosato, su producto de transformación (AMPA) y el glufosinato, ante la imposibilidad de incluirlos en el método multirresiduo anteriormente descrito. Los métodos fueron optimizados y validados tanto en muestras de agua subterránea como superficial siguiendo el “espíritu” de las Buenas Prácticas de Laboratorio, según los criterios de las guías SANCO de la Union Europea, estableciendo los parámetros de linealidad, especificidad, exactitud y precisión. En el caso del glifosato y AMPA, el método fue además validado en muestras de suelo. Posteriormente, la metodología se aplicó al análisis de muestras reales, con el fin de obtener información sobre el nivel de contaminación de las aguas de la Comunidad Valenciana. En tercer lugar, se ha comparado el potencial de los distintos equipos instrumentales utilizados en cuanto a su poder de confirmación de plaguicidas y TPs en muestras reales de agua, de acuerdo con las actuales guías europeas (2002/657/EC). Se han mostrado ejemplos ilustrativos de muestras reales de agua, sobre las que se han detectado diferentes plaguicidas y TPs, y se han discutido las posibilidades de reportar falsos positivos o falsos negativos. En general, se ha demostrado que el triple cuadrupolo puede utilizarse de manera eficiente para la confirmación de muestras positivas siempre y cuando se adquieran varias transiciones MS/MS. El uso de 2 transiciones SRM (Selected Reaction Monitoring) es una alternativa válida, siempre que se realice una selección adecuada considerando su especificidad. Por lo que se refiere al QTOF, su modo de operar permite monitorizar todos los iones producto simultáneamente sin necesidad de preseleccionarlos previamente, lo que, unido a las medidas de masa exacta, le proporciona un extraordinario potencial con fines identificativos. El QTOF, sin embargo, presenta una