Università degli Studi di Ferrara DOTTORATO DI RICERCA IN BIOLOGIA EVOLUZIONISTICA E AMBIENTALE CICLO XXVI COORDINATORE Prof. Guido Barbujani Basi biochimico-molecolari del contenuto di carotenoidi e fenoli in grano duro e pesco Settore Scientifico Disciplinare BIO/04 Dottorando Tutore Dott. Giberti Samuele Prof. Forlani Giuseppe _____________________________ __________________________ (firma) (firma) Anni 2011/2014 INDICE Pagina 1. Introduzione 1 1.1. Definizione di alimento e concetto di cibo funzionale 1 1.1.1 Il genere Homo e gli alimenti: una storia lunga milioni di anni 2 1.1.2. Health claims 4 1.1.3. Alimenti funzionali: caratteristiche e peculiarità 7 1.1.4. Impatto sociale dei cibi funzionali e il loro mercato 8 1.1.4.1. Il mercato dei carotenoidi 11 1.2. Fitonutrienti: l’importanza del metabolismo secondario 13 1.2.1. Flavonoidi 14 1.2.1.1. Il ruolo fisiologico dei flavonoidi nella pianta 14 1.2.1.2. La biosintesi dei flavonoidi 16 1.2.2. Carotenoidi 21 1.2.2.1. Il ruolo fisiologico dei carotenoidi nella pianta 21 1.2.2.2. L’importanza dei carotenoidi nella nutrizione umana 23 1.2.2.3. La biosintesi dei carotenoidi 25 1.2.2.4. Regolazione delle vie si sintesi dei carotenoidi 29 1.3 Fitonutrienti nelle piante di interesse agronomico 33 1.3.1. Strategie di accumulo di fitonutrienti senza l’impiego dell’ingegneria genetica 38 1.3.2. Accumulo di metaboliti mediante l’utilizzo delle biotecnologie 40 1.3.2.1. Il pomodoro 41 1.3.2.2. Il riso 42 1.3.2.3. La patata 43 1.3.2.4. Altre specie vegetali 44 1.4. Il catabolismo dei carotenoidi: le diossigenasi 45 1.4.1. La famiglia delle carootenoid cleavage dioxygenase 1 (CCD1) 50 1.4.2. La famiglia delle carootenoid cleavage dioxygenase 4 (CCD4) 51 1.4.2.1. Le diossigenasi in pesco 57 1.5. Le lipossigenasi vegetali: meccanismo di azione e classificazione 64 1.5.1. La struttura proteica delle lipossigenasi 66 1.5.2. Il ruolo fisiologico delle lipossigenasi vegetali 67 1.5.2.1. Mobilitazione dei lipidi di riserva (LOX-2 Type1) 68 1.5.2.2. Sintesi del Jasmonato e risposta a stress meccanico (13-LOX Type2) 71 1.5.2.3. Lipossigenasi coinvolte nella risposta ad attacco patogeno (9-LOX) 72 1.5.2.4. Altri ruoli fisiologici delle lipossigenasi vegetali: sviluppo vegetativo, 73 senescenza e proteine di riserva 1.5.3. Il ruolo delle lipossigenasi in frumento duro 74 1.6. Genotipi colorati di grano 80 1.7. Scopo del lavoro 84 1.7.1. Pathway dei carotenoidi in frumento duro 85 1.7.1.1. Risultati attesi 85 1.7.2. Pathway dei carotenoidi in pesco 86 1.7.2.1. Risultati attesi 86 1.7.3. Pathway dei composti fenolici in frumento duro 86 1.7.3.1. Risultati attesi 87 2. Materiali e metodi 88 2.1. Condizioni di crescita della coltura in sospensione liquida di grano 88 2.2. Preparazione degli estratti cellulari 89 2.2.1. Estrazione delle colture cellulari 89 2.2.2. Estrazione di semi di grano 89 2.3. Purificazione delle lipossigenasi di Triticum durum 89 2.3.1. Passaggio desalante su resina Bio-Gel P6DG 89 2.3.2. Separazione per cromatografia a scambio anionico 90 2.3.3. Salting out mediante aggiunta di (NH4) SO4 90 2 2.3.4. Separazione per cromatografia a gel filtrazione 91 2.3.5. Cromatografia negativa su colonna di Reactive-Blue sepharose 91 2.3.6. Cromatografia per adsorbimento su colonna di idrossiapatite 91 2.3.7. Cromatografia liquida ad alta prestazione (FPLC) 92 2.4. Determinazione dell’attività enzimatica delle lipossigenasi 92 2.4.1. Preparazione delle soluzioni dei substrati e delle miscele di reazione 92 2.4.2. Purificazione della luteina da cellule di Chlorella protothecoides 93 2.4.3. Saggi per la rilevazione dell’attività delle lipossigenasi 94 2.4.4. Saggio per la rilevazione dell’attività di metabolizzazione dei 13S-H(P)ODE 95 2.5. Caratterizzazione biochimica dell’attività lipossigenasica 96 2.5.1. Determinazione del valore ottimale di pH 96 2.5.2. Determinazione dei parametri cinetici: K e V 96 M max 2.5.3. Determinazione della stabilità enzimatica 97 2.5.4. Determinazione del contenuto proteico di un campione 97 2.6. Determinazione dell’espressione dei geni Lpx di grano duro 98 2.6.1. Estrazione dell’RNA totale da cellule in coltura di grano duro 98 2.6.2. Sintesi di cDNA 98 2.6.3. Amplificazione dei geni Lpx tramite PCR semi quantitativa 99 2.7. Localizzazione subcellulare delle forme di lipossigenasi di grano duro 100 2.8. Espressione della lipossigenasi di grano duro in risposta al trattamento delle 100 cellule con sostanze ad azione ormonale 2.9. Elettroforesi denaturante su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) 101 2.10. Espressione eterologa e purificazione della CCD4 di Malus domestica 102 2.10.1. Crescita del ceppo BL21(DE3)pLysS di Escherichia coli 102 2.10.2. Preparazione delle cellule competenti e trasformazione 103 2.10.3. Induzione della sintesi della proteina eterologa 104 2.10.4. Estrazione di cellule batteriche 105 2.10.5. Purificazione mediante cromatografia per affinità su GSH-agarosio 105 2.10.6. Idrolisi della GST e purificazione della MdCCD4 mediante FPLC 106 2.10.7. FPLC per gel-filtrazione su colonna di Superose 12 106 2.11. Saggi in vitro per la determinazione dell’attività enzimatica delle diossigenasi 106 2.11.1. Materiale vegetale 106 2.11.2. Isolamento dei cromoplasti 106 2.11.3. Determinazione dell’attività di bleaching dei carotenoidi mediante saggio 108 spettrofotometrico 2.11.4. Determinazione dell’attività di bleaching dei carotenoidi mediante RP-HPLC 108 2.11.5. Analisi statistica dei risultati 108 2.12. Ottenimento di anticorpi contro la PpCCD4 109 2.12.1. Sintesi di peptidi immunogenici sulla base della sequenza della PpCCD4 109 2.12.2. Induzione di anticorpi contro la PpCCD4 in topo 109 2.12.3. Analisi della presenza della PpCCD4 tramite dot blot 109 2.13. Determinazione dei livelli di attività specifica di enzimi-chiave nelle sintesi dei 110 fenoli in grano 2.13.1. Materiale vegetale 110 2.13.2. Caratterizzazione delle diverse forme di 3-deossi-D-arabino-eptulosonato-7- 111 fosfato sintasi 12.3.2.1. Condizioni di crescita della coltura in sospensione liquida di Nicotiana 111 plumbaginifolia e preparazione degli estratti cellulari 2.13.2.2. Saggio in vitro della 3-deossi-D-arabino-eptulosonato-7-fosfato sintasi 111 12.3.2.3. Separazione delle forme di DAHP sintasi mediante cromatografia a scambio 112 anionico 12.3.2.4. Amplificazione dei geni che codificano le due forme plastidiali di DAHP 112 sintasi 2.13.3. Saggio in vitro della fenilalanina ammoniaca liasi 113 2.13.4. Saggio in vitro della calcone sintasi 113 2.13.5. Saggio in vitro della antocianidina sintasi 113 2.13.6. Saggio in vitro della antocianidina reduttasi 114 3. Risultati e discussione 115 3.1. Lipossigenasi in grano duro 115 3.1.1. Due forme di lipossigenasi sono espresse nelle diverse fasi del ciclo di crescita 115 di cellule in sospensione liquida di grano 3.1.2. Le forme di lipossigenasi espresse nella coltura cellulare di grano duro cv 118 Ofanto mostrano una diversa localizzazione subcellulare 3.1.3. Purificazione della Lpx-2 di grano duro 119 3.1.4. Caratterizzazione della Lpx-2 di Ofanto 124 3.1.5. Espressione del gene Lpx-2 e conseguenti livelli di attività specifica in risposta 127 al trattamento delle cellule con sostanze ad azione ormonale 3.1.6. Caratterizzazione della Lpx-B1.2 di Ofanto 129 3.1.7. Espressione del gene Lpx-B1.2 e conseguenti livelli di attività specifica in 131 risposta al trattamento delle cellule con sostanze ad azione ormonale 3.1.8. Differente efficienza di bleaching del β-carotene da parte di Lpx-B1.2 e Lpx-2 131 3.1.9. Evidenza in favore della presenza in cellule di grano duro di un enzima secondario capace di metabolizzare gli idroperossidi prodotti dalle Lpx e 133 catalizzare a alta efficienza il bleaching del β-carotene 3.1.10. Livelli di attività enzimatica delle Lpx e dell’enzima secondario in semi di 136 vari genotipi di grano duro 3.2. Diossigenasi in frutti di pesco 137 3.2.1. Espressione eterologa della CCD4 di Malus domestica 138 3.2.1.1. Purificazione della MdCCD4 all’omogeneità elettroforetica 140 3.2.1.2. Saggi di attività in vitro della MdCCD4 141 3.2.2. Saggi enzimatici in vitro su cromoplasti purificati dalla polpa dei frutti di pesco 143 3.2.3. Livelli di attività di bleaching del β-carotene in frutti di diversi genotipi di 145 pesco 3.2.3.1. Il sistema isogenico RedHaven - RedHaven Bianca 145 3.2.3.1.1. Induzione di anticorpi policlonali contro la PpCCD4 e analisi 147 immunologica dei cromoplasti isolati dai frutti di pesco 3.2.3.2. Il sistema isogenico Cristina - Caldesi 2000 148 3.2.3.3. Il genotipo ancestrale Yumyeong 148 3.2.4. Attività di bleaching del β-carotene in tuberi di patata 150 3.3. Enzimi-chiave nella sintesi dei polifenoli in grano 152 3.3.1. Messa a punto dei saggi enzimatici 153 3.3.2. La DAHP sintasi 153 3.3.2.1. Separazione cromatografica delle isoforme citosolica e cloroplastica della 153 DAHP sintasi da cellule in coltura di N. plumbaginifolia 3.3.2.2. L’andamento dei livelli di attività specifica della DAHP sintasi lungo il ciclo di crescita della coltura di N. plumbaginifolia evidenzia la presenza di due 155 forme cloroplastiche 3.3.2.3. Analisi dell’espressione dei geni della DAHP sintasi cloroplastica in coltura 157 cellulare di N. plumbaginifolia 3.3.2.4. Sequenza dei geni della DAHP sintasi cloroplastica di N. plumbaginifolia 159 3.3.3. Gli enzimi coinvolti nella sintesi delle antocianine sono espressi a bassissimi 161 livelli sia in cellule in coltura che in semi maturi di grano 3.3.4. In semi immaturi di genotipi pigmentati sia di grano tenero che di grano duro i livelli di attività specifica della PAL mostrano patterns differenti da quelli 163 evidenziabili in genotipi non pigmentati 4. Conclusioni e prospettive 165 5. Bibliografia 167 Abbreviazioni e acronimi ABA Acido abscissico ANS Antocianidina sintasi AOS Allene ossido sintasi C3G Cianidina-3-beta-glucopiranoside C4H Cinnamato-4-idrossilasi CCD Carotenoid cleavage dioxygenases CCO Carotenoid Cleavage Oxygenase CDP-ME 4-(citidina 5’-difosfo)-2-C-metil-D-eritritolo CDP-ME2P 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol-2-fosfato CHI Calcone isomerasi CHS Calcone sintasi CHYB β-carotene idrossilasi CHYE -carotene idrossilasi CMK 4-(citidina 5’-difosfo)-2-C-metil-D-eritritolo chinasi CoA Coenzima A CrtB Fitoene sintasi batterica CrtI Fitoene desaturasi batterica CRTISO Carotenoide isomerasi CRTW β-carotene chetolasi CrtY Licopene β-ciclasi batterica CS Corismato sintasi CTP Citidina pirofosfato DAHP 3-deossi-D-arabino-eptulosonato-7-fosfato  DES Divinil etere sintasi DFR Diidroflavonolo-4 reduttasi DMAPP Dimetilallil pirofosfato DNA Acido desossiribonucleico DOXP 1-deossi-D-xilulosio 5-fosfato DXP 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato DXPS o DXS 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato sintasi DXR 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato reduttoisomerasi E4P Eritrosio-4-fosfato EPSP 5-enolpiruvil-scichimato-3-fosfato  ER Reticolo endoplasmatico ESPS sintasi 5-enol-piruvil-scichimato-3-fosfato sintasi  F3’5’H Flavonoide-3’5’-idrossilasi F3’H Flavonoide-3’-idrossilasi FNS Flavone sintasi FOSHU Food for specified health uses European Commission Concerted Action on Functional Food FUFOSE Science in Europe GALT Sistema linfatico associato alla mucosa intestinale GFP Green fluorescent protein GGPP Geranilgeranil-pirofosfato GGPS o GGDP Geranil-difosfato-sintasi HDR 1-idrossi-2-metil-2-E-butenil 4-difosfato reduttasi HDS 1-idrossi-2-metil-2-E-butenil 4-difosfato sintasi HMBPP 1-idrossi-2-metil-2-E-butenil 4-difosfato HOD Acido ossiottadecadienoico HOT Acido ossiottadecatrienoico HPL Idroperossido liasi HPLC High Pressure Liquid Chromatography HPOD Acido idroperossiottadecadienoico HPOT Acido idroperossiottadecatrienoico IFS Isoflavone sintasi ILSI International Life Science Institute IPP Isopentenil pirofosfato LCYB o β-LYC Licopene β-ciclasi LCYE o ε-LYC Licopene -ciclasi LDL Low density lipoprotein LHCII Light harvesting complex II (complesso antenna II). LOX Lipossigenasi MCT 2-C-metil-D-eritritolo 4-fosfato citidiltransferasi MDS 2-C-metil-D-eritritolo 2,4-ciclodifosfato sintasi MECP 2-C-metil-D-eritritolo 2,4-ciclodifosfato MEP 2-C-metil-D-eritritolo 4-fosfato MVA Acido mevalonico NCED 9-cis-epossicarotenoide diossigenasi NPQ Non photochemical quenching NXS o NSY Neoxantina sintasi OPDA Acido 12-osso-fitodienoico PAL Fenilalanina ammoniaca liasi PDS Fitoene desaturasi PEP Acido fosfoenolpiruvico PSY Fitoene sintasi PUFA Acidi grassi poli-insaturi RDA Raccomended dietary (o daily) allowance RNA Acido ribonucleico RNAi RNA interference ROS Specie reattive dell’ossigeno SCFAs Acidi grassi a catena corta TAC Contenuto totale di antocianine TAG Triacilgliceroli TAL Tirosina ammoniaca liasi TE Trolox Equivalenti TEAC Attività antiossidante in Trolox equivalenti TPC Contenuto totale di polifenoli VAD Deficienza da vitamina A VDE Violaxantina de-epossidasi VOC Composti organici volatili ZDS ζ-carotene desaturasi ZEP Zeaxantina epossidasi Z-ISO ζ -carotene isomerasi Un pensiero speciale a Giuseppe, maestro di scienza e di vita, che ha permesso la realizzazione di questo sogno. Grazie per tutto quello che hai fatto e che continui a fare, ho trovato un amico prima che un professore! Un ringraziamento dal cuore anche ai ragazzi del Laboratorio di Fisiologia e Biochimica Vegetale, in particolare Davidino, Berta, Davidone, Dodo, Andrea e Marco con cui ho trascorso momenti indimenticabili. 1. INTRODUZIONE Se fossimo in grado di fornire a ciascuno la giusta dose di nutrimento ed esercizio fisico, né in difetto, né in eccesso, avremmo trovato la strada per la salute. Ippocrate (460-377 a.C.) 1.1. Definizione di alimento e concetto di cibo funzionale Per alimento si intende, facendo riferimento al Reg. CE gennaio 2002, n. 178 (art. 2), "qualsiasi sostanza o prodotto trasformato, parzialmente trasformato o non trasformato, destinato ad essere ingerito o di cui si prevede ragionevolmente che possa essere ingerito da esseri umani. Sono comprese bevande, gomme da masticare e qualsiasi sostanza, inclusa l’acqua, intenzionalmente incorporata negli alimenti nel corso della loro produzione, preparazione o trattamento". Più in generale possiamo dire che nella concezione comune il termine alimento viene riferito a un cibo o a una bevanda che garantisce all’individuo macro- e micro-nutrienti necessari al mantenimento e allo sviluppo delle funzioni dell’organismo. Il concetto di alimento funzionale, definito in epoca moderna, in verità non è nuovo: già in tempi remoti Ippocrate, il famoso medico dell’antichità, sosteneva la filosofia del “cibo come medicina”; il Corpus Hippocraticum conteneva infatti tra gli altri anche manoscritti dedicati alla dieta, agli alimenti e all’alimentazione nelle malattie acute. Dopo la caduta dell’impero Romano il sistema ippocratico generò due correnti di pensiero, l’autoctono e l’islamico. Quest’ultimo diede origine alla medicina araba, mentre il primo è sopravissuto in occidente grazie al monachesimo, all’opera di Benedetto da Norcia, e alla successiva scuola Salernitana. La Medicina Salernitana è basata su concetti ancora oggi di piena attualità: il regimen sanitatis diceva infatti che attenendosi a uno stile di vita opportunamente configurato, dove gli alimenti possono contribuire al mantenimento della salute e alla prevenzione dell’insorgenza di patologie, il sano si conserva tale mentre il malato ha possibilità di guarigione. Dal punto di vista scientifico è a partire dal XX secolo che si intravvedono le potenzialità salutistiche del cibo, come dimostra la “teoria delle vitamine” contro la pellagra, a opera di Casimir Funk. Durante la prima metà del secolo vennero identificati i nutrienti essenziali e, con l’obiettivo di promuove l’accrescimento e il mantenimento dell’organismo umano, se ne stabilirono dei parametri di assunzione. Vennero successivamente pubblicati i valori di riferimento dei nutrienti, come ad esempio l’apporto nutrizionale, e linee guida come la piramide alimentare che contiene raccomandazioni sul fabbisogno giornaliero. Complice lo sfrenato sviluppo economico di alcuni paesi, a partire dagli anni ’70 si iniziò parlare di sovra-alimentazione, condizione sconosciuta nel passato e che ha portato rapidamente a uno smisurato incremento della spesa sanitaria (Mascie-Taylor et al., 2003), e a raccomandare di evitare un consumo elevato di certi tipi di nutrienti. Ricerche scientifiche hanno infatti dimostrato che nutrirsi con grassi saturi, colesterolo, zuccheri semplici ecc., accresce l’insorgenza di numerose patologie croniche come quelle vascolari, obesità, diabete e molti tipi di tumori (McCullough et al., 2002). Si è quindi cercato di migliorare la qualità della vita attraverso un’alimentazione specifica ricca di alimenti carenti dei nutrienti "incriminati", volta a favorire la salute riducendo i rischi di malattie. Il concetto moderno di alimento funzionale ha origine negli anni ’80 in Giappone, dove le autorità sanitarie riconobbero la necessità di migliorare la qualità della vita utilizzando un’alimentazione capace di favorire lo stato di benessere e ridurre i rischi di contrarre malattie (Arai, 1996). Visto la tendenza della popolazione a invecchiare, la strategia del governo nipponico era tesa 1 a contrastare l’insorgere di patologie croniche negli individui anziani cercando di controllare altresì la spesa sanitaria. Infatti se da un lato si assisteva a un incremento esponenziale di questo tipo di patologie dovute allo stile di vita sedentario e iper-alimentato, l’aspettativa di vita della popolazione cresceva per via dei notevoli progressi scientifici in grado di offrire nuovi farmaci e terapie. In tale contesto sono stati definiti gli alimenti funzionali, la cui prima regolamentazione risale al 1991, quando l’autorità giapponese definì i FOSHU (Foods for Specific Health Use). In Europa, invece, la materia è rimasta poco definita fino al 1999, quando con i “Scientific Concepts of Functional Foods in Europe” redatti dall’International Life Science Institute, si è affermato che “un alimento può essere definito funzionale se è dimostrato con sufficiente chiarezza il suo effetto positivo su una o più funzioni dell’organismo in modo tale da essere rilevante per il miglioramento dello stato di salute o il benessere o nella riduzione del rischio di malattie. Tali prodotti devono essere sotto forma di comuni alimenti, e devono poter esercitare i loro effetti sulla base di un normale consumo. Non devono necessariamente esercitare effetti su tutta la popolazione”. Quest’ultimo è un concetto da sottolineare perché indica che un cibo può essere funzionale anche solo per determinate categorie di individui, come ad esempio bambini, anziani o donne in gravidanza. Se dunque un tempo l’obiettivo della dieta era quello di fornire tutti i nutrienti richiesti dall’organismo, rispondendo alle esigenze di base, nasce ora un nuovo concetto di nutrizione che prevede l’ottimizzazione del fabbisogno giornaliero dei nutrimenti e la ricerca di componenti atti a favorire il mantenimento della salute. Ponendo attenzione a quest’ultimo termine, esso non definisce più come in passato l’assenza di malattia, ma più che altro il raggiungimento del cosi detto wellbeing, ovvero una situazione di completo benessere fisico, psichico e sociale. Questa nuova concezione di salute ha contribuito a ridefinire il concetto di alimentazione e la consapevolezza scientifica che certi alimenti sono particolarmente benefici per l’organismo in virtù dei loro componenti ha portato a rivalutare molti cibi tradizionali di uso comune come frutta, verdura, cereali integrali, latte e derivati, che vengono considerati oggigiorno come funzionali. Il concetto di alimentazione cambia così da “positivo” a “ottimale” passando da una cultura dell’emergenza a una di prevenzione (Uauy et al., 2009), dove gli alimenti funzionali costituiscono la chiave di volta di tale cambiamento. Così come le malattie da denutrizione, anche le patologie dovute a un regime dietetico eccessivo o squilibrato posso essere prevenute e curate correggendo l’alimentazione e lo stile di vita (regimen sanitatis). La moderna dietologia deve tenere quindi conto di svariati fattori e ha la necessità di essere una scienza multidisciplinare che si avvale del contributo di chimica e biochimica, biofisica e fisiologia, tossicologia, farmacologia e genetica. L’obiettivo ultimo consisterà nel determinare la dieta perfetta in base al patrimonio genetico dell’organismo: se si riuscirà a comprendere l’interazione tra i geni, fattori nutrizionali e patologie, si potrà attuare una prevenzione specifica per ogni singolo individuo. La nutrigenomica, che studia le interazioni tra i singoli geni e gli alimenti, è l’ultima frontiera dell’alimentazione funzionale, e creerà la possibilità di focalizzarsi su una selezione alimentare personalizzata in modo da individuare il regime dietetico più idoneo, non alla popolazione in generale, ma a un individuo nello specifico (Subbiah, 2008). 1.1.1. Il genere Homo e gli alimenti: una storia lunga milioni di anni Ogni specie animale ha a disposizione una nicchia alimentare entro la quale scegliere e consumare il suo nutrimento e dispone degli strumenti per procacciarsi gli alimenti più adatti. L’uomo, che appartiene al sottotipo dei Vertebrati e alla classe dei Mammiferi, ordine dei Primati e famiglia degli Ominidi, non ha strumenti adatti alla cattura e all’uccisione di altri animali: i muscoli elastici e affusolati ci permettono di correre e nuotare agilmente, ma non di afferrare prede in movimento, l’assetto dentale e il movimento laterale della mandibola ci 2