Universidade Federal do Paraná - UFPR Setor de Ciências Biológicas Departamento de Anatomia ANÁLISE MORFOQUANTITATIVA DAS CÉLULAS DE SCHWANN E FIBROBLASTOS DE NERVO SURAL DE RATOS WISTAR IDOSOS SUBMETIDOS AO QUADRO DIABÉTICO Professora Orientadora: Profa. Dra. Djanira Aparecida da Luz Veronez Discente: Thiago Alan Alves dos Anjos Curitiba 2016 THIAGO ALAN ALVES DOS ANJOS ANÁLISE MORFOQUANTITATIVA DAS CÉLULAS DE SCHWANN E FIBROBLASTOS DE NERVO SURAL DE RATOS WISTAR IDOSOS SUBMETIDOS AO QUADRO DIABÉTICO Monografia apresentado à disciplina Trabalho de Conclusão de Curso II do Curso de Graduação em Biomedicina, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná. Orientadora: Professora Doutora Djanira Aparecida da Luz Veronez Curitiba 2016 RESUMO O Diabetes é um problema epidemiológico de abrangência mundial em ascensão nos últimos anos, com provável interferência de mudanças sociais e culturais que refletem no estilo e qualidade de vida das pessoas. O aumento da prevalência do Diabetes em indivíduos idosos associado ao envelhecimento da população mundial faz com que esta seja a faixa etária mais acometida por neuropatia periférica diabética. Esses danos nervosos podem ser de natureza sensitiva, autonômica ou motora. Nesse sentido, o objetivo desta pesquisa foi desenvolver uma análise morfoquantitativa das células de schwann e fibroblastos de nervo sural de ratos Wistar idosos submetidos ao quadro diabético. Utilizaram-se 60 ratos Wistar machos cedidos pelo Biotério do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná – UFPR, distribuídos em dois grupos constituídos por 30 animais senescentes submetidos ao modelo experimental de Diabetes Mellitus tipo II por meio da administração via intraperitoneal de Estreptozotocina e 30 animais senescentes normais sem tratamento. Decorrido o tempo de vida, os animais foram anestesiados com Xilasina e Cetamina, perfundidos via transcardíaca com solução salina e formalina a 10% para posterior remoção dos ramos terminais do nervo sural. Foram montadas lâminas com secções transversais do nervo sural com sete micrometros de espessura e em seguida, coloração em Hematoxilina- Eosina. Para análises quantitativas as lâminas foram fotodocumentadas em fotomicroscópio binocular axiophoto (Zeiss, D-7082), acompanhadas por uma escala métrica. Em seguida, as imagens foram calibradas e analisadas por meio do programa Image J® para obtenção da quantificação dos núcleos de células de schwann e núcleos de fibroblastos. A média obtida nos indivíduos normoglicêmicos foi de 4,58 células de schwann por quadrante e 0,56 fibroblastos, para indivíduos hiperglicêmicos a média foi de 4,52 células de Schwann e de 0,54 fibroblastos. Os resultados obtidos permitiram concluir que não houve alteração significativa entre o grupo controle e o grupo induzido ao quadro diabético. Essa análise permite concluir que somente a hiperglicemia não é capaz de promover alteração na quantidade de células de Schwann e fibroblastos no nervo. Esses resultados corroboram com outros estudos dentro da literatura. Palavras-chave: Diabetes. Envelhecimento. Neuropatia Periférica. Morfometria. Nervo Sural. ABSTRACT Diabetes is an epidemiological problem that reaches entire world with visible increase in the frequency of the disease in recent years by social and cultural changes that reflect the lifestyle of people and quality of life. In addition, the aging of the world population is related to the increasing prevalence of diabetes in the elderly, thus comprising the main age group affected with diabetic peripheral neuropathy. In this sense, the objective of this research was to develop a morpho-quantitative analysis of schwann cells and sural nerve fibroblasts of elderly Wistar rats submitted to diabetic patients. For it will be used 60 male Wistar rats conceded by Vivarium Sector of Biological Sciences, Federal University of Paraná - UFPR, divided into two groups consisting of 30 senescent animals treated with type II diabetes by administering intraperitoneal of streptozotocin and 30 senescent animals normal untreated. Elapsed time of life, the animals will be anesthetized with xylazine and ketamine, perfused via transcardially with saline and 10% formalin for later removal of the sural nerve terminal branches. Slides are mounted with cross-sections of the sural nerve with seven microns thick and then staining with hematoxylin-eosin. For morphoquantitative analysis the slides will be photo documented in light microscope binocular axiophoto (Zeiss, D-7082), accompanied by a metric scale. Then the images are calibrated and analyzed by the program Image J to obtain the quantification of schwann cell nuclei and fibroblast nuclei. The mean values obtained in the normoglycemic individuals were 4.58 schwann cells per quadrant and 0.56 fibroblasts. For hyperglycemic individuals, the mean was 4.52 schwann cells and 0.54 fibroblasts. The obtained results allowed to conclude that there was no significant change between the control group and the group induced to the diabetic group. This analysis allows to conclude that only hyperglycemia is not able to promote alteration in the amount of schwann cells and fibroblasts in the nerve. These results corroborate with other studies within the literature. Keywords: Diabetes. Aging. Peripherical Neuropathy. Morphometry. Sural nerve. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 5 1.1 EVIDÊNCIAS DE INTERESSE ............................................................................................................ 5 1.2 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................... 6 2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................................................... 7 3. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................................... 8 3.1 ETIMOLOGIA .................................................................................................................................. 8 3.2 DEFINIÇÃO DE DIABETES ............................................................................................................... 8 3.3 EPIDEMIOLOGIA DO DIABETES NO BRASIL E NO MUNDO ............................................................ 9 3.4 QUESTÕES SOCIOECONÔMICAS DO DIABETES ............................................................................. 9 3.5 FISIOPATOLOGIA DO DIABETES ................................................................................................... 10 3.6 NEUROPATIA PERIFÉRICA DIABÉTICA .......................................................................................... 12 3.7 ALTERAÇÕES DOS AXÔNIOS E DA BAINHA DE MIELINA NO QUADRO DIABÉTICO ..................... 13 3.8 COMPOSIÇÃO MORFOLÓGICA DO NERVO .................................................................................. 14 3.8.1 ENDONEURO ........................................................................................................................ 14 3.8.2 PERINEURO ........................................................................................................................... 14 3.8.3 EPINEURO ............................................................................................................................. 15 3.9 CÉLULAS DE SCHWANN ............................................................................................................... 15 3.10 FIBROBLASTOS........................................................................................................................... 16 4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................................... 17 4.1 Aspectos Éticos ............................................................................................................................ 17 4.2 Animais ........................................................................................................................................ 17 4.3 Análise MORFOQUANTITATIVA das células de schwann e fibroblastos ..................................... 18 4.4 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ESTATÍSTICO ........................................................................... 20 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................................... 21 6. CONCLUSÕES ..................................................................................................................................... 26 7. CRONOGRAMA .................................................................................................................................. 27 8. REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................... 28 5 1. INTRODUÇÃO 1.1 EVIDÊNCIAS DE INTERESSE Segundo Tanqueiro et al. (2013) mais de um quarto da população entre os 60-79 anos tem Diabetes, demonstrando haver correlação direta entre o aumento da prevalência do Diabetes com o envelhecimento. As implicações econômicas e sociais relacionadas ao tratamento do quadro, tendo em vista que a patologia é crônica, refletem num problema de Saúde Pública. Pace et al., (2002) relata que a maior parte dos custos diretos do Diabetes relaciona-se com as suas complicações, que muitas vezes podem ser reduzidas, retardadas ou, em certos casos, evitadas. Dependendo do país, as estimativas disponíveis indicam que o Diabetes pode gerar de 5 a 14% das despesas de atenção de saúde para tratamento de complicações desencadeadas pelo quadro diabético. Dentre as complicações do Diabetes em idosos: retinopatia, infartos do miocárdio silenciosos, nefropatias, e neuropatia periférica nas mãos e, principalmente, nos pés. Transtornos neuropáticos e isquêmicos causam ulcerações nos pés dos pacientes diabéticos. As ulceras no pé, fato que precede a amputação, são grande causa de morbimortalidade dos pacientes. A neuropatia diabética periférica é diagnosticada por histórico clínico do paciente e exame físico do pé, mas exames como eletromiografia ou biópsia também são importantes. Especialistas afirmam que é extremamente importante que pacientes diabéticos façam a inspeção rotineira de seus pés. Estudos anteriores ressaltam que é necessária uma avaliação minuciosa dos pés dos diabéticos por parte dos profissionais da saúde. Pace et al., (2002) explicam que essa investigação básica é por meio da avaliação dermatológica, estrutural, circulatória e da sensibilidade tátil pressórica, além das condições higiênicas e características dos calçados, sendo estes últimos fundamentais para manter a saúde dos pés, e que essa análise contribui para diminuir o risco de morbidades nos pés dos diabéticos e consequentemente, suas complicações. As células de Schwann e os fibroblastos são de extrema importância para homeostase do nervo, pois estão relacionadas com reparo e cicatrização das fibras danificadas. 6 1.2 OBJETIVO GERAL O objetivo dessa pesquisa é observar se o quadro diabético em ratos Wistar idosos interfere no número de células de schwann e de fibroblastos, comparando o grupo de 30 ratos normoglicêmicos com o grupo de 30 ratos hiperglicêmicos submetidos ao modelo experimental de Diabetes Mellitus tipo II. 7 2. JUSTIFICATIVA O diabetes é um problema de saúde pública mundial, especialmente em países em desenvolvimento. A prevalência do quadro vem aumentando no decorrer dos anos. Além disso, Sartorelli & Franco (2003) ressaltam que as afecções muitas vezes são subnotificadas, e essas são figuradas como causa do óbito. O quadro diabético possui grande relevância na saúde, pois seu quadro acomete diversas disfunções, tais como, retinopatia, nefropatia, alterações cardiovasculares, e neuropatia. A neuropatia é uma complicação muito frequente no diabetes. Esse distúrbio pode afetar o Sistema Nervoso Autônomo, nervos das extremidades do corpo, nas regiões das mãos e pés, sendo a forma mais comum, denominada neuropatia periférica, embora nervos proximais, como o nervo femoral, também possam ser acometidos. Como Silveira & Silveira (1994) explicaram, a forma mais comum de neuropatia diabética é a polineuropatia periférica simétrica. Ela se caracteriza pela perda sensorial simétrica, afetando principalmente os membros inferiores em suas porções distais. A perda motora e o envolvimento dos membros superiores também ocorrem, mas são menos frequentes em relação aos membros inferiores. Os sintomas, que frequentemente se iniciam insidiosos, consistem de insensibilidade, sensação de queimação e dores em pontada. A neuropatia diabética representa a complicação crônica mais prevalente, afetando 30 a 50 % dos pacientes com Diabetes, e 80% desses casos se manifestam como polineuropatia sensório-motora distal simétrica. Em torno de 15% dos pacientes com neuropatia diabética desenvolvem úlceras, configurando a principal causa de amputação não traumática nos membros inferiores Costenaro et al., (2015). É indubitável a relevância do impacto do Diabetes dentro da sociedade atual e futura, segundo levantamentos epidemiológicos. Estudos de quantificação celulares são indispensáveis para o entendimento do quadro como um todo, apesar de suas funções bem elucidadas em indivíduos normoglicêmicos, as células de Schwann e fibroblastos dentro de uma condição hiperglicêmica podem sofrer alterações morfofuncionais, esse estudo tem como objetivo contribuir para melhor entendimento do efeito de glicemia elevada sobre nervos de pacientes diabéticos. 8 3. REVISÃO DA LITERATURA 3.1 ETIMOLOGIA A origem do nome diabetes vem do grego “dia” significado “através de”, “baiten” quer dizer “ir” ou “passar” e “mellitus” ou “melito” está relacionado ao latim “mellis” significa mel. (DOS SANTOS et al., 2014) 3.2 DEFINIÇÃO DE DIABETES Diabetes Insipidus é uma doença caracterizada pela eliminação de grandes volumes de urina muito diluída. Esta doença é causada pela disfunção da parte posterior da glândula pineal, que passa a secretar quantidades inadequadas de arginina-vasopressina, também chamado de hormônio antidiurético (diabetes insípida neurogênica ou central), levando a incapacidade do rim em responder à arginina-vasopressina circulante (diabetes insípida nefrogénica) Velasquez & Medeiros (2014). De acordo com SPD (2015) apud Martins et al., (2015) o Diabetes Mellitus é a designação usada para descrever uma desordem metabólica com múltiplas etiologias caracterizada por uma hiperglicemia crônica resultante de distúrbios no metabolismo dos carboidratos, lipídeos e proteínas, que são resultado de deficiências na secreção e/ou ação da insulina, ou de ambas. Ferreira et al., (2014) associaram a definição da doença à qualidade de vida. Afirmam que Diabetes Mellitus compreende um grupo de distúrbios metabólicos de etiologia variada, resultante da secreção deficiente de insulina pelas células beta-pancreáticas, da resistência periférica a insulina ou de ambas. É uma doença muito associada ao sedentarismo e maus hábitos alimentares. Guimarães (2015) define Diabetes Mellitus como um conjunto de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia e está associada a complicações, disfunções e insuficiência de múltiplos órgãos, especialmente, rins, coração, cérebro, vasos sanguíneos e olhos. 9 3.3 EPIDEMIOLOGIA DO DIABETES NO BRASIL E NO MUNDO Segundo Pereira et al., (2014), o Diabetes Mellitus está entre as principais causas de morbimortalidade. Sua prevalência mundial tem aumentado rapidamente, especialmente entre os países em desenvolvimento. No Brasil, em 2010, a prevalência geral estimada, incluindo os tipos 1 e 2 entre adultos idosos, foi de 6,4% (aproximadamente 12 milhões). Destaca-se, no entanto, que o aumento da prevalência da doença é verificado em todo o mundo. Havia 371 milhões de diabéticos no mundo em 2012. Estima-se que, em 2030, cerca de 552 milhões de pessoas terão diabetes. Isto equivale a um diabético a cada 10 adultos, significando que, para se chegar a esse número, surgirão três novos casos a cada 10 segundos. O tipo 1 apesar de ser menos comum que o tipo 2 dentro da população, também vem aumentando a cada ano, sendo a prevalência mundial desse tipo de 0,1% a 0,3%, com cerca de 78.000 novos casos novos a cada ano. 3.4 QUESTÕES SOCIOECONÔMICAS DO DIABETES Segundo Picon (2011) o Diabetes está entre as doenças mais estudadas da atualidade, devido à morbidade a que expõe os pacientes e ao significado contingente de gastos que demanda seu tratamento. Apesar dos grandes esforços científicos em todos os campos da área da saúde no sentido de mitigar a doença, ainda existem milhares de pessoas acometidas e outras que, sabidamente, virão a sofrer das importantes limitações decorrentes do avanço do Diabetes, quando da instalação de um quadro irreversível de degeneração nervosa: a neuropatia periférica diabética. Atualmente o Diabetes Mellitus é um problema comum e grave para a saúde global. O quadro de Diabetes cresceu em conjunto com rápidas mudanças sociais e culturais, tais como o envelhecimento das populações, urbanização, mudanças na dieta, pouca atividade física e outros comportamentos que não são saudáveis, e está associado a várias complicações que diminuem a qualidade de vida e a sobrevivência de indivíduos afetados, segundo Shikata et al., (2013). Cortez et al., (2015) dizem que no Brasil, o Ministério da Saúde criou vários programas que impactam a maioria da população para controlar doenças crônicas, como é o caso do Diabetes Mellitus, o Programa Nacional de Hipertensão e Diabetes Mellitus - Hiperdia foi criado em 2002, em uma tentativa de reorientar a assistência farmacêutica para o