UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ CAROLINA PEROTTONI CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA HETERÓLOGA COM POTENCIAL IMUNOGÊNICO CONTRA Corynebacterium diphtheriae Kruse, 1886 CURITIBA 2015 ii CAROLINA PEROTTONI CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA HETERÓLOGA COM POTENCIAL IMUNOGÊNICO CONTRA Corynebacterium diphtheriae Kruse, 1886 Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Setor de Tecnologia da Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Orientador: Profa. Dra.Vanete Thomaz Soccol Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol CURITIBA 2015 iii iv Dedico este trabalho aos meus pais, José Carlos e Maria Luzia que sempre me fizeram acreditar em mim mesma e na realização dos meus sonhos! v AGRADECIMENTOS À Prof.a Dr.a Vanete Thomaz Soccol, professor Visitante e Orientador do núcleo permanente do Programa de Mestrado e de Doutorado em Processos Biotecnológicos, orientadora desta dissertação, por seu constante estímulo, paciência, apoio e orientação. Com a Professora, aprendi muito e estas lições levarei para a vida. Ao Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol, do Setor de Tecnologia da Universidade Federal do Paraná, pela oportunidade oferecida e pela contínua luta pela excelência da ciência em nosso país. Aos meus pais e a meu irmão, por todo o suporte, compreensão, paciência e por me acompanhar e acreditar em mim durante toda esta jornada. À Diretoria Executiva do Instituto de Tecnologia do Paraná - Tecpar, por acreditar em meu potencial, concedendo a oportunidade de desenvolver este projeto dentro de suas instalações da instituição e fornecendo as condições necessárias. À minha amiga e colega de trabalho, Thaísa Scheuer presente em todas as etapas do desenvolvimento deste trabalho, sempre auxiliando, aconselhando e levando as situações com desembaraço que nos fizeram chegar até aqui. Ao Prof. Dr. Odir Delagostin, da Universidade Federal de Pelotas, por nos ceder o vetor pAE, e juntamente com a Prof.a Dr.a Sibele Borsuk e todos os professores e colegas do Curso de Vacinologia Reversa II, pelos conhecimentos adquiridos. Ao colega de trabalho Osvaldo Schreder Junior, por nos ceder a cepa de C. diphtheriae e orientações, indispensáveis para o desenvolvimento deste trabalho. À Silvana Maria Alban, Mitiyo Miyaoka, Gilberto Delinski e Ludmilla Troiano Della Coletta pela disponibilidade, protocolos e explicações. À Taís Canova e Cristiane Marco da Universidade Positivo, pela disponibilidade e auxilio. A todos os colegas de pós-graduação: Denise Salmon, Felipe Brisk, Alfredo Walter, Sidnei Bordignon, Carlos Sanchuki, Siliane Berté, Mário Bier, Júlio Frison e Ricardo Cancio Frendrich pelo apoio e momentos de descontração. vi Ao Professor Emanuel Maltempi e Caroline Kukolj pela realização da análise da proteína por MALDI-TOF. À todos os colegas do Laboratório de Química Fina, Controle de Qualidade, e Laboratório de Antígenos Veterinários do Tecpar, por todo suporte e reagentes, em especial Marcelo Ribani, Adriana Fontana de Mattos, Jairo Luiz Labiak, Rubens Chaguri, Gilberto Delinski Jr. e Luciana Requião. À todos os colegas do Laboratório de Produtos Bacterianos de Uso Humano e da Garantia da Qualidade, em especial Andréa Muggiati de Abreu, Elder Ribeiro, Antônio Carlos de Souza e Alana Mariele Rodrigues Galdino. Aos meus primos queridos Alexandre Tazoniero, Priscilla Tazoniero e Rafael Silveira pelo incentivo durante a elaboração desta dissertação, e em especial à Stefanía Svala Óskarsdóttir e Marilia Caputo que providenciaram as condições necessárias para tal. A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para o desenvolvimento desta dissertação. vii RESUMO O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína recombinante com potencial imunogênico contra Corynebacterium diphtheriae, que possa ser utilizada como vacina de subunidade. A cepa de C. diphtheriae foi utilizada para clonagem do gene da subunidade B da toxina por ser a porção imunogênica da molécula. O produto da clonagem foi inserido no vetor de expressão pAE, e amplificado em Escherichia coli DH5 alfa. Para a expressão da proteína, o plasmídeo contendo o inserto foi transfectado em E. coli BL21 pLysS. As melhores condições de expressão da proteína recombinante foram 31ºC, 0,3 mM de indutor (IPTG) e 3 horas de indução, sendo significativo somente para a fração solúvel da proteína. A proteína foi purificada em coluna de afinidade de níquel. As endotoxinas foram removidas com triton X114, sem perda significativa da proteína durante o processo (380 µg/mL). A taxa de recuperação foi de 33% e o rendimento final foi de 348 µg/mL. A proteína foi sequenciada com 99% de similaridade com a subunidade B da toxina diftérica, apresentando-se como antígeno promissor para o desenvolvimento de uma vacina contra a difteria. Palavras-chaves: Corynebacterium diphtheriae, Difteria, Toxina Diftérica Subunidade B, Vacina de Subunidade. viii ABSTRACT The aims of this work was to produce a recombinant protein with immunogenic potencial against Corynebacterium diphtheriae, which can be used as a subunit vaccine. The C. diphtheriae was used for cloning the B subunit of the diphtheria toxin gene, as it is the immunogenic portion of the molecule. The PCR product was inserted into the cloning vector pAE and amplified in Escherichia coli DH5alfa. To the protein expression, the plasmid containing the insert was trasnfected into E. coli BL21 pLysS. The best culture conditions were 31ºC, IPTG 0.3 mM e 3 hours of induction, being significant only to the soluble fraction. The protein was purified by nickel affinity column and endotoxins were removed with Triton X-114, with no significant protein loss (380 µg/mL). The recovery rate was 33% with the final yield of 348 µg/mL. The protein was sequenced and showed 99% of similarity to the diphtheria toxin B subunit. The heterologous protein, here produced, is a promising antigen for a vaccine production against the diphtheria disease. Keywords: Corynebacterium diphtheriae, Diphtheria, Diphtheria Toxin, Diphtheria Toxin Subunit B, Subunit Vaccine. ix LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 – FOTOMICROGRAFIA DE Corynebacterium diphtheriae CORADO COM AZUL DE METILENO. .............................................................................................. 22 FIGURA 2 – DESENHO ESQUEMÁTICO DA TOXINA DIFTÉRICA. ....................... 23 FIGURA 3 – PRODUÇÃO DA TOXINA DIFTÉRICA EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA. ......................................................................................................... 24 FIGURA 4 – (A) LESÃO DE PELE. (B) PSEUDOMEMBRANA EM NASOFARINGE. (C) PACIENTE COM GÂNGLIOS ENFARTADOS. .................................................. 26 FIGURA 5 – TOTAL DE CASOS DE DIFTERIA x COBERTURA VACINAL DE 1980 A 2006. ..................................................................................................................... 28 FIGURA 6 – CASOS DE DIFTERIA NO CONTINENTE AMERICANO NOS ÚLTIMOS 10 ANOS. .................................................................................................................. 29 FIGURA 7 – ETAPAS DO PROCESSO DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE DA SUBUNIDADE B DA TOXINA DE C. diphtheriae. .................................................................................................................................. 37 FIGURA 8 – ETAPAS DO PROCESSO DE CLONAGEM DA SUBUNIDADE B DA TOXINA DIFTÉRICA................................................................................................. 38 FIGURA 9 – DESENHO DO VETOR pAE. ............................................................... 41 FIGURA 10 – O VETOR pAE COM O INSERTO DIFB. ........................................... 42 FIGURA 11 – ETAPAS DA PRODUÇÃO DAS CÉLULAS RECOMBINANTES ........ 46 FIGURA 12 – ETAPAS DE EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE. .................................................................................................... 56 FIGURA 13 – FOTOMICROGRAFIA DO CULTIVO DE C. diphtheriae. ................... 61 FIGURA 14 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE A 1% DA EXTRAÇÃO DO DNA DO C. diphtheriae.. ........................................................................................... 62 FIGURA 15 - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE CONTENDO OS PRODUTOS DE PCR. A SETA INDICADA O FRAGMENTO CLONADO POR PCR. .................................................................................................................................. 63 FIGURA 16 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DO SCREENING DAS COLÔNIAS COM O PLASMÍDEO INSERIDO. A SETA INDICA A PRESENÇA DE PLASMÍDEO. ............................................................................................................ 64 x FIGURA 17– ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1% DO PLASMÍDEO PAE EXTRAÍDO DO CULTIVO DE E.coli DH5alfa.. ............ Erro! Indicador não definido. FIGURA 18 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1% DOS PRODUTOS DE DIGESTÃO DO PLASMÍDEO pAE COM AS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO BamHI e HindIII. ...................................................................................................................... 65 FIGURA 19 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1% DA DIGESTÃO DO GENE DA SUBUNIDADE B DA TOXINA DIFTÉRICA PELAS ENZIMAS BamHI e HindIII. ...................................................................................................................... 65 FIGURA 20 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1% DO SCREENING DAS COLÔNIAS APÓS TRANSFORMAÇÃO. .................................................................. 66 FIGURA 21 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1% DA DUPLA DIGESTÃO DO PLASMÍDEO COM AS ENZIMAS BamHI E HindIII EXTRAÍDO E PURIFICADO DAS COLONIAS OBTIDAS NO SCREENING DA TRANSFECÇÃO. ....................... 67 FIGURA 22 – GEL SDS-PAGE DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE. .................................................................................................................................. 68 FIGURA 23 – GEL SDS-PAGE DA SOLUBILIDADE DA PROTEÍNA RECOMBINANTE. .................................................................................................... 69 FIGURA 24 – WESTERN BLOT DA FRAÇÃO INSOLÚVEL CONTRA ANTICORPOS ANTI-HIS 6. .............................................................................................................. 70 FIGURA 25 – CURVA DE CRESCIMENTO DA E.coli BL 21 TRANSFECTADA (CONCENTRAÇÃO CELULAR (g/L) X TEMPO (h). ................................................. 71 FIGURA 26 – VELOCIDADE DE CRESCIMENTO DA E.coli BL 21 TRANSFORMADAS. ................................................................................................ 72 FIGURA 27 – AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO TEMPO DE INDUÇÃO NO PERFIL DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE. .............................................. 73 FIGURA 28 – GEL SDS-PAGE DA EXPRESSÃO EM DIFERENTES CONDIÇÕES DA FRAÇÃO SOLÚVEL DA PROTEÍNA RECOMBINANTE (37kDa). ...................... 74 FIGURA 29 – GEL SDS-PAGE DA EXPRESSÃO EM DIFERENTES CONDIÇÕES DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DA PROTEÍNA RECOMBINANTE. ................................ 74 FIGURA 30 – DIAGRAMA DE PARETO COM AS CONDIÇÕES DAS FERMENTAÇÕES PARA O PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DA FRAÇÃO SOLÚVEL. ................................................................................................................ 76