UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM QUÍMICA JORGE LUÍS OLIVEIRA SANTOS ESTRATÉGIAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE NITRITO E NITRATO EM MATRIZES AMBIENTAIS E ALIMENTÍCIAS, EMPREGANDO ANÁLISE DE IMAGENS DIGITAIS Salvador 2013 JORGE LUÍS OLIVEIRA SANTOS ESTRATÉGIAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE NITRITO E NITRATO EM MATRIZES AMBIENTAIS E ALIMENTÍCIAS, EMPREGANDO ANÁLISE DE IMAGENS DIGITAIS Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Química. Orientador: Profa. Dra. Djane Santiago de Jesus Co-orientador: Prof. Dr. Oldair Donizeti Leite Salvador 2013 AGRADECIMENTOS A DEUS por ter me inundado com o seu amor e me sustentado com sua mão poderosa. A sociedade brasileira por ter financiado a minha vida acadêmica. A FAPESB e ao CNPQ por ter financiado a minha pesquisa e ao programa de pós-graduação em química da UFBA pelo apoio dado. A Profa. Dra. Djane Santiago de Jesus por ter confiado na minha capacidade em desenvolver este trabalho e, mesmo passando por momentos difíceis, não deixou de me orientar. Ao Prof. Dr. Oldair Donizeti Leite, um amigo e parceiro que tanto devo. Os meus agradecimentos são eternos. A minha esposa Jeisivane Oliveira e a minha filha Maria Vitória Oliveira pela paciência e amor dispensado em mim. Aos meus Pais (João e Célia) e aos meus irmãos por serem as minhas principais referências. Ao ICADS, nas pessoas do Diretor Prof. Dr. Jacques Antonio de Miranda e da ex- diretora Profa. Dra. Joana Angélica Luz por terem me dado todas às condições para realização desse trabalho. A Profa. Dra. Maria de Lourdes Botelho, ex- diretora do IQ/UFBA, por ter me recebido e acolhido tão bem nesse Instituto. Aos meus amigos Técnicos administrativos do ICADS/UFBA e do IQ/UFBA: Clóves Genário, Jorge Luis Nicoletti, Maria Conceição G. S. Souza, Silvana S. Tosta e José E. Uchoa. Gosto das cores, das flores, das estrelas, do verde das árvores, gosto de observar. A beleza da vida se esconde por ali, e por mais uma infinidade de lugares, basta saber, e principalmente, basta querer enxergar. Clarice Lispector . RESUMO Este trabalho foi realizado no âmbito do projeto PRONEX/Água-FAPESB. É proposta uma nova estratégia para determinação de nitrito e nitrato em sistema em fluxo por multicomutação e detecção por imagens digitais. Também foi proposta uma estratégia simples para determinação de nitrito por imagem digital combinado com spot test à base de papel de filtro. Os métodos foram baseados na reação do nitrito com a sulfanilamida, formando um cátion de diazônio que posteriormente é acoplado ao dicloreto de N-(1-naftil) etilenodiamina formando um diazo composto de coloração rósea com absorção máxima em 543 nm. No sistema em fluxo os sinais analíticos foram obtidos a partir das intensidades de coloração do diazo composto nas imagens digitais obtidas por um webcam e os valores foram medidos através do software image J. Na determinação do nitrato, este foi reduzido em fluxo a nitrito por uma coluna de cádmio cobreado. As condições do sistema em fluxo foram otimizadas e a concentração de nitrato e nitrito foram determinados respectivamente na faixa de 1,0 - 10,0 mg L-1 com precisão de 1,3% e 0,2 - 2,0 mg L-1 com precisão de 0,6%. Os limites de detecção e quantificação para nitrito foram 0,014 mg L-1 e 0,045 mg L-1 e para o nitrato 0,042 mg L-1 e 0,252 mg L-1, respectivamente. O procedimento em fluxo foi aplicado com sucesso em amostras de águas subterrâneas na frequência analítica de 103 amostras/h para nitrito e 80 amostras/h para nitrato. No caso do spot test o diazo composto foi formado na superfície do papel de filtro pela adição de 5μL da solução amostra e em seguida 5μL de regente cromogênico e a intensidade da cor foi medida a partir das imagens digitais do spot test. As imagens digitais do spot test foram obtidas através do uso de scanner e o sinal analítico foi obtido pelo tratamento das imagens com o software image J. O spot test foi otimizado e a concentração de nitrito foi determinada nas faixas de 0,2 - 1,0 mg L-1 (r=0,9924) e 1,0 - 10,0 mg L-1 (r=0,9989) com limites de detecção de 0,04 mg L-1 e 0,07 mg L-1, respectivamente. O spot test proposto foi aplicado na determinação de nitrito em amostras de salsichas e água subterrânea e os resultados encontrados foram nas faixas de 21,71- 23,88 mg kg-1 e 0,04 - 0,12 mg-N L-1, respectivamente. . Palavras-chave: Nitrato, Nitrito, Imagens Digitais, Análise em fluxo, Spot test ABSTRACT This work was carried out under the project PRONEX/Água-FAPESB. This proposes a new strategy for the determination of nitrite and nitrate by multicommutation flow injection system and detection for digital images. Also proposed was a simple strategy for determination of nitrite combined with a digital image based on spot test filter paper. The methods are based on the reaction of nitrite with sulfanilamide, forming a diazonium cation which is then coupled to dichloride N- (1- naftil)ethylenediamine form a diazo compound of pink color with maximum absorption at 543 nm. In the flow system analytical signals were obtained from the intensities of staining diazo compound in digital images obtained by a webcam and the values were measured by image J software. In the determination of nitrate, this flow was reduced to nitrite by a copper-plated cadmium column. The terms of the flow system were optimized and the concentration of nitrite and nitrate were determined respectively in the range 1,0-10,0 mg L-1 with precision of 1.3% and 0,2-2,0 mg L-1 with precision of 0.6%. The limits of detection and quantification were 0,014 mg L-1 and 0,045 mg L-1 to nitrite and nitrate 0,042 mg L-1 and 0,252 mg L-1 respectively. The flow procedure has been successfully applied in groundwater samples in throughput of 103 samples/h for nitrite and 80 samples/h nitrate. For the spot test the diazo compound was formed on the surface of the filter paper by the addition of 5μL of the sample solution and then 5μL of chromogenic conductor and the color intensity was measured from the digital image of the spot test . Digital images of the spot test were obtained by use of a scanner and the analytical signal is obtained by processing of images with the image J software. The spot test was optimized and nitrite concentration was determined in the range of 0,2 - 1,0 mg L-1 (r=0,9924) and 1,0 - 10,0 mg L-1 (r=0,9989) with limits of detection of 0,04 mg L-1 and 0,07 mg L-1 respectively. The spot test was applied to the determination of nitrite in sausage and groundwater samples and the results were in the range from 21,71 - 23,88 mg kg-1 and 0,04 - 0,12 mg-N L-1, respectively. Keywords: Nitrate, Nitrite, Digital image, Flow analysis, Spot test LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mecanismo de reação envolvida no método de Griess. Fonte: RAMOS (2006). ....................................................................................................................... 27 Figura 2 - Amostragem de dados contínuos. Fonte: Google imagens ....................... 32 Figura 3 - Imagens digitais com diferentes quantidades de pixel, a) 4840px, b) 1210px e c) 484px ..................................................................................................... 33 Figura 4 - Esquema de aquisição de imagem por uma câmera digital ...................... 34 Figura 5 - Exemplo de níveis discretos de intensidade (tons de cinza) admitida por um pixel. .................................................................................................................... 35 Figura 6 - Sensibilidade dos cones da retina em função do comprimento de onda .. 37 Figura 7 - Cubo do modelo de cores RGB ................................................................ 38 Figura 8 - Diagrama do módulo de análise em fluxo utilizado na determinação de nitrito e nitrato. C: Tampão (pH=7,2); A: Amostra; R: Reagente de Griess ( 2,3 % de sulfanilamida; 0,12 % de NED em H PO 0,5 mol L-1); CR: coluna redutora de 3 4 cádmio cobreado ( 3mm d.i. x 6 cm); B1: Bobina de amostragem (0,8 mm d.i x 60 cm); B2: Bobina de reação helicoidal (0,8 mm d.i. x 90cm); x e y : pontos de confluência; D: detector. ........................................................................................... 47 Figura 9 - Formulário utilizado na Interface com o usuário ....................................... 50 Figura 10 - Fotografia do sistema em fluxo utilizado na determinação de nitrito e nitrato. ....................................................................................................................... 51 Figura 11 - Interface do programa image J com as imagens em stack ..................... 58 Figura 12 - Interface do programa image j com o stack das imagens acompanhado da tabela de resultados dos valores de RGB de cada imagem do stack. ................. 59 Figura 13 - Espaço vetorial RGB e o vetor v representando uma cor. Fonte: (LYRA, 2008) ......................................................................................................................... 60 Figura 14 - Avaliação da precisão na determinação de nitrito, empregando no módulo de análise da Figura X para propulsão da solução reagente; válvula V , bomba 4 peristáltica (A) e gravidade (B). ................................................................................ 65 Figura 15 - Efeito da vazão de fluxo sobre o sinal analítico de uma solução padrão 1mg L-1 de nitrito. Medidas feitas com reagente de Griess (0,1% de NED, 2% sulfanilamida, 0,5 mol L-1 H PO ) na vazão de 2,1 mL min-1 e em bobina de reação 3 4 (B2) com 100cm. ....................................................................................................... 66 Figura 16 - Efeito do Tamanho da bobina de reação no sinal analítico de uma solução padrão de nitrito 1mg L-1. Medidas realizadas com reagente de Griess e transportador nas vazões de 4,3 e 2,1 mL min-1, respectivamente. .......................... 67 Figura 17 - Efeito do numero de ciclos em diversas condições de volume de reagente e amostra (R+A, 2R+A, R+2A e 2R + 2A) sobre o sinal analítico. ............. 68 Figura 18 - Resposta previstas pelo modelo quadrático ........................................... 72 Figura 19 - Superfície de resposta descrita pela equação Absorbância = 49,67 + 2,19NED – 2,46(NED)2 + 2,86(Sulf.) – 2,71(Sulf.)2 + 0,25(NED)(Sulf.), que relaciona a concentração do NED( %, m/v) e da Sulfanilamida (% , m/v) com o sinal analítico (Norma). .................................................................................................................... 73 Figura 20 - Efeito da acidez da solução transportadora sobre a redução de nitrato a nitrito ......................................................................................................................... 74 Figura 21 - Diminuição da resposta analítica após analises de amostras de água fortificadas com 1,0 mg L-1 (A) de nitrato e 10,0 mg L-1 (B). ...................................... 76 Figura 22 - Curva analítica (B) obtida para determinação de nitrito empregando webcam e imagens digitais com o sinal transiente correspondente (A). ................... 78 Figura 23 - Curva analítica (B) obtida para determinação de nitrato empregando webcam e imagens digitais com o sinal transiente correspondente (A). ................... 79 Figura 24 - Correlação entre os dados obtidos na determinação de nitrito (A) e nitrato (B) pelo método proposto de pelos métodos referência ............................................ 83 Figura 25 - Imagem do spot test para determinação de nitrito .................................. 92 Figura 26 - Interface do programa image j com a imagem do spot test, acompanhado da tabela com os resultados dos valores de RGB das regiões selecionadas na imagem. .......................................................................................... 94 Figura 27 - Avaliação da estabilidade do azo composto, através de medidas sucessivas (intervalos de 15min) da cor do produto colorido após realização da reação no spot test. ................................................................................................... 97 Figura 28 - Correlação entre os resultados da norma para diferentes concentrações de nitrito (0,2-10 mg L-1) obtidos em imagens com diferentes resoluções. .............. 98 Figura 29 - Curva analítica obtida para determinação de nitrito na faixa de 0,2 a 1 mg L-1 empregando o spot test proposto ......................................................................... 99 Figura 30 - Curva analítica obtida para determinação de nitrito na faixa de 1 a 10 mg L-1 empregando o spot test proposto. ...................................................................... 100