UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Insumos Farmacêuticos ALEXANDRA DE ALMEIDA HÜBNER Caracterização fitoquímica e eficácia fotoprotetora clínica de formulações cosméticas contendo extrato do bagaço de uva Cabernet Sauvignon São Paulo 2017 ALEXANDRA DE ALMEIDA HÜBNER Caracterização fitoquímica e eficácia fotoprotetora clínica de formulações cosméticas contendo extrato do bagaço de uva Cabernet Sauvignon Versão Corrigida Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas para obtenção do título de Mestre Orientadora: Profa. Dra. Elfriede Marianne Bacchi Co-orientador: Prof. Dr. André Rolim Baby São Paulo 2017 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP HÜBNER, A. A. Caracterização fitoquímica e eficácia fotoprotetora clínica de formulações cosméticas contendo extrato do bagaço de uva Cabernet Sauvignon. 2017. 161f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Aprovado em: _____/____/ 2017 Banca Examinadora Prof.(a) Dr.(a) ________________________________________________________ Instituição: ________________________________________________________ Julgamento: ________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) ________________________________________________________ Instituição: ________________________________________________________ Julgamento: ________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) ________________________________________________________ Instituição: ________________________________________________________ Julgamento: ________________________________________________________ DEDICATÓRIA Dedico essa dissertação aos meus amados, pais Antonina (in memorian) e Alvino, pelo amor, afeto, estímulo e valorização da educação. Muita saudade... Ao meu amado, amante e companheiro marido Alexsander, pelo amor, incentivo e força em todos os momentos. Imensa gratidão! Aos meus queridos filhos Nicolas Alexsander e Nadine, pela compreensão e amor incondicional. AGRADECIMENTOS À Deus, Jesus Cristo e ao Divino Espírito Santo por iluminar meus caminhos. À minha família, por ser o esteio da minha vida e a Rosa Maria por todo seu zelo, carinho e dedicação à minha casa e família. À minha companheira leal de quatro patas, Piti, pelas alegrias, amor e carinho ilimitado. Aos meus mestres imenso respeito e admiração. À minha querida orientadora e pesquisadora exemplar, Profa. Dra. Elfriede Marianne Bacchi, pela paciência, confiança e ensinamentos científicos e de vida. Ao meu querido co-orientador e visionário pesquisador, Prof. Dr. André Rolim Baby, pela sugestão do objeto de estudo e pelos valiosos conhecimentos transmitidos e experiências compartilhadas. Serei eternamente grata a vocês! Ao querido Prof. Dr. Felipe Rebello Lourenço, pela paciência, ajuda com as análises microbiológicas e suporte estatístico. À querida Profa. Dra. Ingrit Elida Collantes Díaz pela competência química, ensinamentos e parceria. As queridas funcionárias da Central Analítica - IQ/USP Dra. Giovana C. de Freitas Lemeszenksi e Dra. Vânia A. B. Bueno Silva pela elucidação dos espectros de massas. Aos queridos professores doutores Nilsa Sumie Yamashita Wadt, José Luiz Aiello Ritto, Felipe Rebello Lourenço, Camila Areias de Oliveira e Ismael Ivan Rockenbach pelo aprendizado e conselhos durante exame de qualificação e a defesa da dissertação de mestrado. À querida Profa. Dra. Nádia Araci Bou Chacra pela colaboração no desenvolvimento das formulações. Aos queridos mentores, Profa. Dra. Edna Tomiko Myiake Kato, Prof. Dr. Paulo Chanel Deodato de Freitas, Profa. Dra. Dominique Corinne Hermine Fischer e Prof. Dr. Gabriel Lima Barros de Araújo, pelo exemplo de pessoas e profissionais, carinho e ensinamentos. À querida amiga e colega Flavia, pela paciência, conselhos e o imenso apoio na execução e compreensão dos resultados experimentais. Aos parceiros de laboratório Leandro e Alberto, por toda a ajuda e ensinamentos. Aos colegas acadêmicos Kasia, Rodrigo, Eduardo, André, Michelle, Camila, Thamires, Mirela, Maíra e Iván, pelo convívio, auxílio, carinho e crescimento intelectual, em especial ao meu amigo Rodrigo pela ajuda nas ilustrações químicas e os nossos bate-papos. Aos queridos amigos e técnicos dos laboratórios de farmacognosia, cosmetologia, análises clínicas e toxicologia, Roberto de Jesus Honório, Claudinéia Aparecida Sales de Oliveira Pinto e Edgar Muniz Machado Junior e Cristina Moreno, pela amizade e ajuda nos experimentos. Ao Laboratório de Fitoquímica do Instituto de Biociências, em especial à Profa. Dra. Déborah Yara Alves Cursino dos Santos e à técnica de laboratório Mourisa Maria de Sousa Ferreira, pela ajuda e cuidado com o material vegetal. Ao Laboratório de Extração da Universidade Paulista, Profa. Dra. Ivana Barbosa Suffredini e ao técnico de laboratório Sergio Alexandre Frana pela cooperação. Aos funcionários David Olimpio de Lima Filho, Alexandre Spitalere, Doralice Rita de Jesus Santos, Jorge Alves de Lima, Irineu Ruel de Oliveira e, pelo apoio afetivo e Técnico- Administrativo. Ao Instituto de Pesquisa Clínica Integrada, pela parceria nos ensaios clínicos, em especial à Gerente de Pesquisa Clínica Fernanda Daud Sarruf, pelos ensinamentos e ajuda nas correções do manuscrito. À querida Dra. Daniela Dal Molim Ghisleni por todo apoio e ajuda. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, pelo suporte técnico-científico e desenvolvimento humano e ao CNPq, pelo auxílio da bolsa. A todos meu muito obrigada por me ajudarem a concluir mais essa etapa da minha vida! “Eu sou uma das que pensam que a ciência tem uma grande beleza. Um cientista em seu laboratório não é apenas um técnico: é também uma criança colocada ante fenômenos naturais que o impressionam como um conto de fadas.” Marie Curie RESUMO HÜBNER, A. A. Caracterização fitoquímica e eficácia fotoprotetora clínica de formulações cosméticas contendo extrato do bagaço de uva Cabernet Sauvignon. 2017. 161f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Com o avanço no desenvolvimento industrial sustentável estão sendo exploradas novas aplicações de uso dos subprodutos agroindustriais. O bagaço de uva obtido a partir da vinificação ou produção de sucos mantém importantes quantidades de polifenóis em suas cascas, sementes e engaço após o processamento, úteis para proteção da pele contra os raios ultravioleta. Neste contexto, o objetivo do nosso estudo foi caracterizar quimicamente o extrato do bagaço de uva Cabernet Sauvignon e avaliar a sua segurança e eficácia clínica em fotoprotetor tópico. Nesta dissertação, o extrato hidroetanólico (70% v/v) do bagaço de uva total, incluindo cascas, sementes e engaços de Vitis vinifera L., foi obtido por percolação seguido de liofilização. Os ensaios divididos em duas etapas: i) In vitro: determinação dos fenólicos totais (FT) usando Folin-Ciocalteu e expresso em equivalentes de ácido gálico (GAE); flavonoides por meio da reação com tricloreto de alumínio e expresso em quercetina; atividade antioxidante do extrato e das formulações através da desativação de radicais livres de DPPH● expressa em equivalentes de Trolox (TE); identificação dos principais compostos fenólicos do extrato bruto por espectrometria de massa (HPLC/ESI-MS/MS); desenvolvimento de nove formulações usando o delineamento experimental; medição dos valores de transmitância das formulações referentes ao fator de proteção solar (FPS), fotoestabilidade e fator de proteção UVA (FP-UVA) através do equipamento Labsphere UV-2000S® e ii) Em seres humanos, apenas duas formulações foram avaliadas clinicamente, C sem extrato e com filtros UVA e UVB: butilmetoxidibenzoilmetano, etil-hexilmetoxicinamato e etil-hexildimetil PABA (11,5% p/p) e D com extrato (bagaço de uva 10% p/p) e filtros UV. Inicialmente, a segurança dermatológica, irritabilidade e sensibilização; fototoxicidade e fotossensibilização foram avaliadas pelo Teste de Contato Repetitivo em Humanos (HRIPT). Posteriormente, a eficácia fotoprotetora clínica foi testada na pele de dez voluntários. O teor de FT encontrado no extrato de bagaço de uva foi de 141,11 ± 3,38 mg GAE.g-1 e de flavonoides 3,01 ± 0,14 mg QE.g-1. A eficácia antioxidante das soluções metanólicas com extrato e fotoprotetor na concentração de 1 mg.mL-1 em peso seco em pH 5 e 7 foram aproximadamente: 707 μmol TE.g-1 e 520 μmol TE.g-1, respectivamente. Isto significa uma queda em torno de 26,45% da capacidade antioxidante do extrato quando incorporado à formulação. Foram identificadas por espectrometria de massa dezenove substâncias fenólicas, entre elas dímeros e trímeros de procianidinas, di-hidroflavonol, flavonóis e antocianidinas. Os resultados demonstraram efeito sinérgico entre os filtros UV e extrato vegetal no FPS e efeito antagônico com a variação do tempo de irradiação sobre as respostas do FPS, atividade antioxidante, comprimento de onda crítico, proteção UVA, proteção UVB e razão UVA/UVB. A melhor combinação eficiência-resposta foi detectada na formulação D com um aumento do FPS in vitro em cerca de 210%. Os testes de segurança não induziram qualquer reação adversa. A eficácia fotoprotetora clínica de D foi 21% (10,20 - 12,30) superior em relação à formulação C, demonstrando maior eficiência na proteção UVA. Sendo assim, C e D foram consideradas seguras para uso tópico e D estatisticamente superior tanto na proteção UVA quanto UVB comparado à amostra só associada de filtros. Logo, o bagaço de uva é um promissor ingrediente sustentável multifuncional útil para o uso em protetor solar. Palavras-chave: Vitis vinifera L., FPS, Fator de proteção UVA, Teste de Contato Repetitivo em Humanos, Fotoestabilidade. ABSTRACT HÜBNER, A. A. Phytochemical identification and clinical photoprotective efficacy of cosmetic formulations containing Cabernet Sauvignon grape pomace extract. 2017. 161f. Dissertation (Master of Science) - Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, 2017. With the advance in sustainable industrial development, new applications of agro-industrial by-products are being explored. Grape pomace obtained from winemaking or juice production keeps important amounts of polyphenols in their skins, seeds and stalks after processing that are useful for protection of skin against ultraviolet rays. In this context, the objective of our study was to chemically characterize Cabernet Sauvignon pomace extract and to evaluate its safety and clinical efficacy in topical photoprotector. The hydroethanolic extract (70% v/v) of the Vitis vinifera L. whole grape pomace, including seeds, skins and stalks, was obtained by percolation after lyophilization. The tests were divided into two stages: i) In vitro: total phenols (TF) using Folin-Ciocalteu and expressed in Gallic Acid Equivalent (GAE); flavonoids by reaction with aluminum trichloride and expressed as quercetin; antioxidant activity of the extract and formulations by inhibition by DPPH● expressed as Trolox equivalents (TE); identification of the main phenolic compounds of the crude extract by mass spectrometry (HPLC/ESI-MS/MS); development of nine formulations using experimental design and evaluated the SPF, photostability and UVA protection factor (UVA-PF) through the Labsphere UV-2000S® equipment; ii) In humans, only two formulations were clinically evaluated, C without extract and with UVA and UVB filters: butilmetoxidibenzoilmetano, etil-hexilmetoxicinamato and etil-hexildimetil PABA (11.5% w/w) and D with extract (10% w/w grape pomace) and filters UV. Initially, the dermatological safety, irritability and sensitization; phototoxicity and photosensitization were evaluated by the Human Repeat Insult Patch Test (HRIPT). After, the clinical photoprotective efficacy was tested on the skin of ten volunteers. The FT content found in the dried extract was 141.11 ± 3.38 mg GAE.g-1 and flavonoids 3.01 ± 0.14 mg QE.g-1. The antioxidant potential of the methanolic solutions with extracts and photoprotectors at the concentration of 1 mg.ml-1 in dry weight and at pH 5 and 7 were around: 707 μmol TE.g-1 and 520 μmol TE.g-1, respectively. This means a drop of about 26.45% of the antioxidant capacity of the extract when incorporated into the formulation. Mass spectrometry identified nineteen phenolic substances, among them procyanidins dimers and trimmers, di-hydroflavonol, flavonols and anthocyanin. The results showed a synergistic effect between the UV filters and the herbal extract in the SPF and the antagonistic effect with the variance of the irradiation time in the SPF responses, antioxidant activity, critical wavelength, UVA protection, UVB protection and UVA/UVB ratio. The best efficiency-response combination was detected in the D formulation with an in vitro SPF increase of about 210%. Safety tests did not induce any adverse reaction. The clinical efficiency of D photoprotection was 21% (10.20 - 12.30) higher than the C formulation, demonstrating high efficiency in UVA protection. Thus, C and D were considered safe for topical use and D statistically superior in both UVA and UVB protection to the only combined sample of filters. Therefore, grape pomace is a promising multifunctional sustainable ingredient qualified to be used in sunscreen industry. Keywords: Vitis vinifera L., SPF, UVA protection factor, Human Repeat Insult Patch Test, Photostability.