Universidade de Sa˜o Paulo Instituto de F´ısica Microscopia Hologr´afica Digital Aplicada na An´alise de Tecidos Biol´ogicos M´arcio Andr´e Prieto Aparicio Lopez Orientador: Prof. Dr. Mikiya Muramatsu Disserta¸c˜ao apresentada ao Instituto de F´ısica da Universidade de S˜ao Paulo para obtenc¸˜ao do t´ıtulo de Mestre em Ciˆencias Comiss˜ao Examinadora: Prof. Dr. Mikiya Muramatsu (IFUSP) Prof. Dra. Ligia Ferreira Gomes (FCFUSP) Prof. Dr. Niklaus Ursus Wetter (IPEN) S˜ao Paulo 2012 Quando terminei a graduac¸a˜o em f´ısica, em um dos discursos de cola¸ca˜o de grau, um garoto leu o discurso que escreveu para a sua turma e pessoas presentes. O diretor do Instituto, em seu discurso final, dentre os discursos dos formandos, citou uma frase dita pelo garoto, que resumia o que se tinha passado aquela noite, e o que seria dali em diante a vida dos mesmos: ”E depois desta, que venham outras batalhas” Quando eu falei esta frase - e vez ou outra repito para mim mesmo - nem refleti o qua˜o atual e verdadeira ela continua sendo, tanto quanto antes, agora e para sempre. Todo esfor¸co empregado na realizac¸a˜o deste trabalho dedico `a mem´oria de meu pai, Cimar Alfredo Aparicio Lopez, e `a mem´oria de meu avoˆ, Torquato Aparicio Palacios. Onde quer que estejam, levo seus ensinamentos comigo para me guiar nesta vida sempre. Dedico este trabalho ao meu irma˜o, Cimar Alejandro Prieto Aparicio, e a minha ma˜e, Maria Teresa Prieto Aparicio, pelo carinho e apoio de sempre. ”Confundo para Esclarecer, Esclare¸co para Complicar, Complico para Explicar” i Agradecimentos Minha fam´ılia, pelo apoio, carinho e incentivo que sempre terei. Ao Professor Mikiya Muramatsu, pela oportunidade de realizar este trabalho, que me permitiu ingressar no mundo da Pesquisa. E aos seus conselhos, ensinamentos, que vou levar para toda minha vida e, o principal, sua amizade. ´ Aos meus colegas e amigos do Grupo de Optica e Sistemas Amorfos, pelo conv´ıvio, ´ amizade e aux´ılio: Jonny, Luis Augusto, B´arbara, Gabriel, Luana, Maria Clara, Isis, Diogo Soga, Julia, Luis Roberto, Maristela, Talita, Giedson, WIlliam, Marcel... ` A Secretaria do Departamento de F´ısica Geral do IFUSP, Dirce, F´atima e Silvana. Aos docentes e alunos das Universidades de Cuba, pelo aux´ılio e colaborac¸a˜o em etapas cruciais do trabalho e, acima de tudo, pela sua simpatia e amizade: Jorge Octavio Ricardo P´erez (Universidad de Oriente), Francisco Palacios Ferna´ndez (Universidad de Oriente), Rolando Serra (Instituto Superior Polit´ecnico Jos´e Antonio Echeverria), Alfredo Moreno (Instituto Superior Polit´ecnico Jos´e Antonio Echeverria), Jos´e Luis Valin Rivera (Instituto Superior Polit´ecnico Jos´e Antonio Echeverria) e Miriela Milagros Escobedo Nicot (Univer- sidad de Oriente). Ao Pessoal do Laborato´rio de Imunoqu´ımica, do Departamento de An´alises Cl´ınicas e Toxicolo´gicas da Faculdade de Ciˆencias Farmacˆeuticas da USP: as alunas Camila e Pamela, e a Professora Ligia Ferreira Gomes, pelo seu aux´ılio, discuss˜oes e conselhos no decorrer do trabalho, e acima de tudo, pela sua amizade. AoConselhoNacionaldeDesenvolvimentoCient´ıficoeTecnol´ogico(CNPq), peloapoio financeiro, que permitiu a realizac¸a˜o deste trabalho. ii Resumo Este trabalho teve como objetivo a aplica¸ca˜o do Microsco´pio Hologr´afico Digital para an´alise de amostras biol´ogicas, por meio de imagens de paraˆmetros f´ısicos e informa¸ca˜o quantitativa de uma amostra, gerados atrav´es de hologramas digitais, o que n˜ao ocorre na holografia cl´assica. O processamento e an´alise dos hologramas digitais foi efetuada por um programa escrito por meio do software MatLab, empregando o m´etodo de Du- pla Propaga¸ca˜o. S˜ao explicados outros m´etodos para tratamento de hologramas digitais, presentes no programa. O m´etodo de Dupla Propaga¸ca˜o foi discutido, destacando suas vantagens frente aos outros m´etodos. Foi aplicado o m´etodo de Volkov para a retirada de ambiguidade de fase. O processo de montagem do Microsco´pio Hologr´afico Digital foi descrito, por apresentar modificac¸o˜es em rela¸ca˜o ao proto´tipo inicial adotado. Sete amostras foram analisadas no Microsco´pio Hologr´afico Digital, trˆes de calibrac¸a˜o e quatro para an´alise - sangue e solu¸ca˜o concentrada de prote´ına denominada β Glico- 2 prote´ına tipo I, ou β GPI. Para calibrac¸a˜o, foram realizados testes de formac¸a˜o de imagem, 2 realizando compara¸ca˜o em quatro microsc´opios descritos e explicados em funcionamento e princ´ıpio envolvidos na formac¸a˜o de imagens, utilizando a mesma amostra; e verifica¸ca˜o das dimenso˜es de uma amostra, por meio de medi¸ca˜o usando ferramentas dispon´ıveis no programa. Umaamostradesanguedeumindiv´ıduoheterozigotoparaHemoglobinaS(ane- mia falciforme) e uma amostra de sangue de um indiv´ıduo homozigoto para hemoglobina A1 (controle normal) foram empregadas na forma de filmes l´ıquidos secos sobre laˆminas de vidro (extens˜ao sangu´ınea). O uso de fixac¸a˜o foi avaliado com a amostra controle. Foram geradas imagens em duas e trˆes dimenso˜es para as amostras biol´ogicas, repro- duzindo as estruturas morfol´ogicas de cada. Para a prote´ına β GPI, a an´alise envolveu 2 somente imagens, sem extra¸ca˜o de valores; apesar disso, os resultados mostraram possibil- idades de aplica¸co˜es em estudos futuros. Grandezas f´ısicas foram calculadas para dois dos componentes sangu´ıneos (Plasma e Eritr´ocito), mostrando valores pro´ximos daqueles con- hecidos anteriormente. Entretanto, alguns valores foram considerados estimativas novas, por n˜ao se conhecer, at´e o momento, nenhum ca´lculo efetuado anteriormente. A an´alise comprovou a formac¸a˜o de imagens e a capacidade de mensura¸ca˜o oferecida pelo aparelho. Devido ao paraˆmetro da fase, foi poss´ıvel extrair informa¸co˜es em trˆes dimenso˜es. iii Abstract This work aimed the implementation of the Digital Holographic Microscope for the analysis of biological samples, using physical parameters images and quantitative data from a sample, both generated through digital holograms, which does not occur in Classical holography. Processing and analysis of holograms were performed by a program written using the MatLab software, applying the Double Propagation method. Other methods for the treatment of digital holograms were explained. The Double Propagation method was discussed, highlighting their advantages over other methods. The method of Volkov was applied for removing phase ambiguity. The Digital Holographic Microscope assembly process was described, because of the modifications made to the initial prototype adopted. Seven samples were analyzed in the digital holographic microscope, three of them for calibration and the other to the analysis - blood and a concentrated solution of a protein called type I β Glycoprotein, or β GPI. Calibration tests were made by observing and 2 2 comparing four image microscopes, described and explained in operation and principles involved in the formation of images, using the same testing sample; and checking the dimensions of another sample through measurement, using digital tools available in the program. Hb S heterozygous (Sickle Cell disease) and Hb A1 homozygous (Control) blood samples were prepared in microscope slide glasses. Images were acquired in two and three dimensions for biological samples, reproducing theirmorphologicalstructures. Forβ GPI,theanalysisinvolved onlyimages, andnovalues 2 were extracted; nevertheless, the results showed potential applications in future studies. Physical quantities were calculated for two blood components (Plasma and Erythrocyte), showing values closer to those previously known. However, some values were considered new estimates, because there is no knowledge of any calculation made previously, until now, using Digital Holographic Microscopy. The analysis proved the formation of images and the measurement capacity offered by the apparatus. Due to the phase parameter, we were able to extract information in three dimensions. iv Lista de S´ımbolos e Abrevia¸co˜es 2D: Duas Dimenso˜es 3D: Trˆes Dimenso˜es λ: Comprimento de Onda ´ η: Indice de Refra¸ca˜o CCD: Charged Coupled Device DP: Dupla Propaga¸ca˜o DRP: Desvio Relativo Percentual EA: Espectro Angular Hb: Hemoglobina IMZ: Interferˆometro Mach-Zehnder MHD: Microsco´pio Hologr´afico Digital NA: Abertura Num´erica OM: Objetiva Microsco´pica PS: Fase PSWP: Fase com Unwrapping RH: Reconstruc¸a˜o Hologr´afica RS2D: Radial Scanning em duas dimenso˜es SFF: Sangue Falciforme Fixado SNF: Sangue Normal Fixado SNNF: Sangue Normal N˜ao Fixado v Conteu´do 1 Introduc¸˜ao 1 2 Conceitos B´asicos de Holografia 4 2.1 Holografia Cl´assica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2.2 Holografia Digital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.3 Microscopia Hologr´afica Digital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 Microsco´pios O´pticos e Microsco´pio Hologr´afico Digital 7 3.1 Campo Claro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3.2 Campo Escuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3.3 Contraste de Fase - Zernike . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.4 Contraste de interferˆencia diferencial - Nomarski . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.5 Microsco´pio Hologr´afico Digital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 ´ 3.6 Microscopia Optica versus Microscopia Hologr´afica Digital . . . . . . . . . 13 4 M´etodos Num´ericos em Reconstru¸c˜ao Hologr´afica 15 4.1 Aproximac¸a˜o de Fresnel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 4.1.1 Aproximac¸a˜o de Fresnel Discreta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.2 Convoluc¸a˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4.3 Espectro Angular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.4 Dupla Propaga¸ca˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.5 Elimina¸ca˜o da ambiguidade da fase - Unwrapping . . . . . . . . . . . . . . 23 4.5.1 Soluc¸a˜o Aproximada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 4.5.2 Soluc¸a˜o Exata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 5 Materiais Biol´ogicos 25 5.1 Sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 5.2 Anemia Falciforme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 5.3 Glicoprote´ına β I - β GPI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 2 6 Parte Experimental 31 6.1 Microsco´pio Hologr´afico Digital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 6.2 Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 6.2.1 Calibra¸ca˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 6.2.2 Importaˆncia do Estudo das Amostras e Preparo . . . . . . . . . . . 37 6.3 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 6.4 Teste Inicial do MHD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 6.4.1 Ret´ıculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 6.4.2 Rede Hexagonal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 vi 7 An´alise e Discuss˜ao das Amostras Biol´ogicas 52 7.1 Sangue Normal Fixado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 7.2 Sangue Falciforme Fixado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 7.3 Sangue Normal N˜ao Fixado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 7.4 An´alise Quantitativa das Amostras de Sangue . . . . . . . . . . . . . . . . 78 7.5 β GPI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 2 8 Conclus˜ao 87 vii Cap´ıtulo 1 Introdu¸c˜ao A holografia (jun¸ca˜o das palavras gregas holos e grafos - ”todo”e ”registro”, respectiva- mente) ´e uma t´ecnica interferom´etrica desenvolvida por Dennis Gabor em 1948, publicada em artigo histo´rico na revista Nature [1]. O objetivo da holografia, quando criada, foi a melhoria e desenvolvimento das t´ecnicas de microscopia, evitando erros introduzidos por elementos ´opticos na gerac¸a˜o de imagens, visando a reconstruc¸a˜o visual tridimensional de uma amostra de interesse. Inicialmente, sua aplica¸ca˜o se deu em microscopia eletroˆnica, us- ando feixe de el´etrons. O grande desenvolvimento da holografia, e sua maior popularidade, ocorreu a partir do ano de 1960, com a invenc¸a˜o do laser, que possibilitou a gerac¸a˜o de uma fonte luminosa monocrom´atica e de alta coerˆencia, permitindo que seu uso se estendesse para a ´optica. Duasaplica¸co˜esconhecidasepopularesdaholografiaest˜aorelacionadas`as´areasdesegu- ranc¸a e entretenimento. No primeiro caso, usada para gerar selo de seguran¸ca hologr´afico, para atestar a origem e autenticidade de produtos vendidos no mercado. No campo do entretenimento e artes visuais, a observa¸ca˜o diferenciada de um objeto, devido ao efeito de terceira dimensa˜o e est´etica proporcionada por meio do processo de registro de sua respectiva imagem, oferecendo grande impressa˜o de realidade. O processo tradicional de holografia utiliza um filme fotogra´fico analo´gico de alta resoluc¸a˜o para registro da imagem de um objeto. A caracter´ıstica fundamental da holografia ´e a capacidade de realizar o registro da in- formac¸a˜o da frente de onda de um objeto, em um meio de registro adequado denominado Holograma, de forma que ela possa ser reconstru´ıda posteriormente, atrav´es da observa¸ca˜o de duas grandezas f´ısicas relacionadas `a frente de onda, que s˜ao intensidade e fase. A im- agem de um objeto observada por meio de um filme fotogra´fico convencional, por exemplo, corresponde ao registro de intensidade, sem a percep¸ca˜o espacial oferecida para um objeto observado por meio de um filme hologr´afico. Na holografia cl´assica, temos o registro da informa¸ca˜o qualitativa, restrita `a observa¸ca˜o dos paraˆmetros f´ısicos, n˜ao permitindo sua quantifica¸ca˜o. A Holografia Digital permite que um holograma obtido de uma amostra, agora holograma digital, ap´os processamento num´erico, fornec¸a informa¸ca˜o num´erica dos paraˆmetros f´ısicos, possibilitando a realizac¸a˜o de an´alise quantitativa. 1