UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Tesis presentada como parte de los requisitos de la Universidad Nacional del Litoral, para la obtención del Grado Académico de: Doctor en Tecnología Química ESTUDIO DE LA INMOVILIZACIÓN DE LA β - GALACTOSIDASA PARA LA REUTILIZACIÓN DE LA LACTOSA DEL SUERO DE QUESERÍA Silvina Andrea Regenhardt Grupo de Ingeniería de Alimentos y Biotecnología Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química (UNL –CONICET) Directora de Tesis: Dra. Amelia C. Rubiolo Codirector de Tesis: Dr. Enrique J. Mammarella Miembros del Jurado de Tesis: Dra. Nora Bértola Dra. Graciela Vignolo Dr. Oscar Iribarren Año 2010 Agradecimientos Quiero expresar mi sincera gratitud en primer lugar a mis directores la Dra. Amelia Rubiolo y el Dr. Enrique Mammarella por sus invalorables aportes para realizar este trabajo, dedicación y permanente quía, por el aliento y empuje constante. A todos los compañeros y amigos del Grupo de Ingeniería de Alimentos y Biotecnología por su aliento y ayuda constante; y en especial, a Daniel por su invalorable ayuda en el laboratorio y por haberme “soportado” incluso en los peores momentos. A todos los integrantes del Departamento de Ingeniería Industrial, en especial los Dres. Germán Rosetti y Oscar Quiroga. A mi compañero de cátedra, el Dr. José Espinosa, por su constante aliento y por sus interesantes sugerencias para el desarrollo de este trabajo. A los miembros del Jurado por el esfuerzo de evaluar este trabajo. A la Facultad de Ingeniería Química por no solo haberme brindado el espacio para alcanzar mi formación académica sino también por hacer posible el desarrollo de mis actividades en docencia. Al Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por otorgarme apoyo financiero, mediante una Beca de Formación de Posgrado. Un agradecimiento muy especial debo hacer al Ing. Mario Sad y al Dr. Pedro Morín por haber colaborado desinteresadamente y por haberme brindado su valioso tiempo. A los Dres. Jorge Reinheimer y Gabriel Vinderola por iniciarme en la labor científica. A Martín, mi esposo, por su cariño, incesante apoyo y estímulo durante todo este proceso. Por estar siempre a mi lado en los tiempos difíciles y también en las alegrías. A mis padres por haberme enseñado el valor del esfuerzo, sin ellos no hubiera llegado hasta aquí. Agradecimientos A mi amada hija, María Pilar que con su sonrisa me da las fuerzas para seguir adelante y no bajar los brazos. A mis queridos amigos y todos aquellos que de alguna manera estuvieron identificados en la culminación de esta etapa. Dedico este trabajo a mis padres y a mi familia. Resumen En el presente trabajo se estudió la reacción de hidrólisis de la lactosa en conjunto con la concentración de proteínas en suero de quesería, empleando una preparación comercial de la enzima β-galactosidasa inmovilizada sobre una membrana plana comercial de ultrafiltración. El proceso enzimático asegura una alta especificidad en la reacción buscada cuando se trabaja con productos heterogéneos, como lo es el suero, y esto, sin modificar al resto de los componentes presentes. La inmovilización de la enzima permite su reutilización en un sistema continuo. Se seleccionó una membrana de ultrafiltración de semejantes características a las utilizadas en las industrias lácteas. Se caracterizó una membrana plana comercial de polietersulfona de 10 kDa de tamaño de corte. En los ensayos experimentales se estudiaron distintas condiciones de inmovilización covalente y multipuntual de la enzima en la membrana, en base a: concentración del agente activante (glutaraldehído) y agregado o no de inhibidores. Se establecieron las condiciones de inmovilización que mejor resultado mostraron en términos de actividad y estabilidad del biocatalizador. Asimismo, se estudió la estabilidad térmica del biocatalizador obtenido ya que, un parámetro muy importante en la performance del sistema es la temperatura. El proceso de concentración de proteínas de suero por ultrafiltración se lleva a cabo, en general, a 55°C. Por otra parte, la temperatura óptima de la enzima comercial se encuentra alrededor de los 37°C. Se encontró que si bien la estabilidad del biocatalizador disminuye al alejarnos de la temperatura óptima, comparando los resultados con los de la enzima libre a 55°C, la estabilidad se incrementa considerablemente. A la enzima se caracterizó cinéticamente adoptando un modelo de Resumen reacción del tipo Michaelis-Menten con inhibición competitiva por producto. Se determinaron las constantes cinéticas de la enzima utilizando soluciones de lactosa y permeado de suero. Además, no se encontraron diferencias entre las constantes cinéticas cuando se utiliza suero de quesería previamente acondicionado y permeado de suero. Se modeló la variación temporal del flujo de permeado de ultrafiltración, para esto se exploraron diferentes modelos matemáticos disponibles en la literatura a fin de encontrar el que mejor representa muestro sistema. También se estudió la variación del flujo de permeado con la temperatura a diferentes presiones de trabajo. A partir del balance de materia en el reactor, se elaboró un modelo matemático que considera la variación temporal del flujo y la desactivación térmica de la enzima. El modelo incluye la estimación de las condiciones de reacción y el ensuciamiento de la membrana. Finalmente, el modelo completo fue corroborado con datos experimentales. Los estudios realizados permitieron obtener un biocatalizador con rendimientos aceptables con la técnica de inmovilización empleada y un modelo matemático de un reactor tanque agitado continuo en estado transiente que incorpora la función que representa la disminución temporal del flujo debido a la concentración de proteínas. Índice 1. Introducción y Objetivos………………………………………………………............... 1 1.1. El suero de quesería…………………………………………………...………………. 2 1.1.1. Obtención y caracterización del suero de quesería…………......…………………. 2 1.1.2. Aprovechamiento industrial de los sueros lácteos……………................................ 5 1.2. Obtención de jarabes edulcorantes……………………………………......................... 7 1.3. Enzimas para la hidrólisis de la lactosa………………………………………….……. 8 1.4. Inmovilización de enzimas……………………………………………........…………. 9 1.5. Reactores para la hidrólisis enzimática con la enzima inmovilizada…...….…………. 10 1.5.1. Reactores de membrana………………………………………...….……………… 12 1.6. Objetivos……………………………………………………………….…...…………. 15 1.6.1. Objetivo general………………………………………………..…..……………… 15 1.6.2. Objetivos particulares…………………………………………..…..……………... 15 2. Aspectos Generales………………………………………..…………………..…………. 17 2.1. Caracterización del suero de quesería………………………………….……………… 18 2.1.1. Proteínas del suero……………………………………………..………………….. 18 2.1.2. Lactosa………………………………………………………..…………………… 19 2.2. Recuperación de las proteínas de suero: Obtención de WPC……….……..………….. 21 2.2.1. Membranas de Ultrafiltración……………………………..……….……………… 22 2.2.1.1. Membranas Sintéticas……………………………...………………………….. 24 2.2.1.1.1. Clasificación de las membranas sintéticas según su composición………… 24 2.2.1.1.2. Clasificación de las membranas sintéticas según su estructura…………… 27 2.2.1.1.3. Clasificación de las membranas sintéticas según su forma……………….. 30 2.2.1.2. Polímeros utilizados para producir las membranas: Membranas de polietersulfona……………….……………….……………….………………………... 32 2.2.2. Proceso de obtención del concentrado de proteínas de suero (WPC).…………….. 34 2.2.2.1. Flujo a través de la membrana de Ultrafiltración……….....…………………... 36 2.2.2.1.1. Características del ensuciamiento (fouling)……..... ……………………… 37 2.2.2.1.2. Factores que afectan el flujo de permeado……..….………………………. 38 2.2.2.1.2.1. Propiedades de la membrana…………..….……………….…………... 38 2.2.2.1.2.2. Propiedades del soluto…………………….…………………………… 40 i Índice 2.2.2.1.2.3. Parámetros operativos del proceso………..…………………………… 42 2.3. Hidrólisis de la lactosa presente en el suero…………………………………………... 44 2.3.1. Enzimas para la hidrólisis de la lactosa…………………………………………… 44 2.4. Procesos de inmovilización de enzimas………………………………………............. 48 2.4.1. Enzimas inmovilizadas como catalizadores en procesos químicos industriales…... 48 2.4.1.1. Mejora de las propiedades de las enzimas vía técnicas de inmovilización y 51 post-inmovilización……………….……………….……………….…………………... 2.4.2. Elección de los soportes…………………….……………………...……………… 52 2.4.3. Métodos de inmovilización…………………….…………………..……………… 54 2.4.3.1. Métodos de inmovilización reversibles.…………………... …………………. 54 2.4.3.2. Métodos de inmovilización irreversibles…………………..………………….. 55 2.4.3.2.1. Entrampamiento…………………….……………..………………………. 56 2.4.3.2.1. Formación de enlaces covalentes………………….………………………. 56 2.4.3.2.2.1. Glutaraldehido en la inmovilización de proteínas…………………….. 58 2.5. Reactores enzimáticos con enzimas inmovilizadas………………………................... 59 2.5.1. Reactores de membrana…………………….……………………...……………... 60 2.6. Cinética de la reacción de hidrólisis de la lactosa catalizada por la enzima β- Galactosidasa……………….……………….……………….……………….…………… 63 2.6.1. Integración de la ecuación cinética en un intervalo de tiempo…….……………… 65 2.6.2. Factores que afectan la cinética de las enzimas…………………………………… 66 2.6.2.1. Influencia del pH sobre la cinética de reacción……………………………….. 66 2.6.2.2. Influencia de la temperatura sobre la cinética de reacción... …………………. 67 2.6.2.3. Influencia de la presencia de efectores sobre la cinética de reacción…………. 69 2.6.2.4. Efectos del proceso de inmovilización………………………………………... 70 2.6.2.4.1. Efectos en la actividad enzimática………………...………………………. 70 2.6.2.4.2. Efectos sobre la estabilidad de la enzima………….………………………. 73 2.6.2.4.3. Pérdida de actividad y vida media de las enzimas inmovilizadas…………. 75 3. Desarrollo del Modelo Teórico………………………………………………………….. 78 3.1. Caracterización de la membrana de Ultrafiltración……………………….................... 79 3.1.1. Modelo de Hagen-Poiseuille…………………….………………………………… 79 ii Índice 3.1.2. Modelo de transferencia de materia………………………………..……………… 81 3.1.3. Modelo de Resistencias…………………….……………………………………... 83 3.2. Modelos matemáticos del flujo de permeado…………………………………………. 85 3.3. Hidrólisis de la lactosa presente en el suero de quesería…………………..………….. 87 3.3.1. Estimación de los parámetros cinéticos…………………………………………… 88 3.4. Desarrollo del modelo para el sistema estudiado…………………………..…………. 89 4. Materiales y Métodos Analíticos………………………………………………………... 95 4.1. Materiales…………………….…………………….…………………………………. 96 4.1.1. Sustrato…………………….…………………….………………………………... 96 4.1.2. Selección de la membrana de ultrafiltración……………………………………… 96 4.1.2.1. Tamaño nominal de corte…………………….……………………………….. 96 4.1.3. Enzima…………………….…………………….………………………………… 97 4.2. Métodos Analíticos…………………….………………………………….................... 98 4.2.1. Determinación de la actividad de la enzima y grado de hidrólisis………………... 98 4.2.2. Caracterización del flujo a través de la membrana………………………………... 99 4.2.2.1. Ensuciamiento de la membrana……………………………………………….. 100 4.3. Reactor de membrana…………………….……………………………….................... 101 4.3.1. Unidad de reacción y separación…………………….……………..……………... 101 4.4. Preparación y caracterización biocatalizador…………………………………………. 102 4.4.1. Activación de la membrana…………………….…………………………………. 102 4.4.2. Inmovilización covalente de la enzima. ………………………….......................... 103 4.4.3. Efectividad del proceso de inmovilización y determinación de la cantidad de enzima ligada……………….……………….……………….……………….………….. 103 4.4.4. Ensayos de permeación. …………………….……………………..……………… 104 4.4.5. Ensayos de hidrólisis. …………………….……………………….……………… 104 4.4.6. Ensayos de estabilidad térmica a 55 °C…………………………………………… 105 4.5. Determinación de las constantes cinéticas para la enzima libre e inmovilizada en la membrana……………….……………….……………….……………….……………….. 106 4.5.1. Usando lactosa como sustrato…………………….………………..……………… 106 4.5.2. Usando permeado como sustrato…………………………………..……………… 107 4.6. Estudio del comportamiento del biocatalizador en el reactor…………………………. 107 iii Índice 4.6.1 Variaciones de los parámetros cinéticos…………………………………………… 108 4.6.2. Estimación de la constante de desactivación de los biocatalizadores……………... 109 5. Resultados y Discusión…………………………………………………………………... 110 5.1. Caracterización de las resistencias de la membrana al flujo…..……………………… 111 5.1.1. Resistencia de la membrana en función de la presión transmembrana 111 aplicada…………………….……………….……………….……………….…………... 5.1.2. Flujo de filtrado de suero en función de la presión transmembrana……………… 112 5.2. Estimación del modelo de flujo de permeado…………………………….................... 114 5.3. Inmovilización de la enzima en la membrana…………………………….................... 118 5.4. Estabilidad Térmica del Biocatalizador………………………………………………. 120 5.4.1. Estimación de la constante de pérdida de actividad de los biocalizadores ………. 120 5.5. Efectividad del proceso de inmovilización de la enzima a 55°C……………………… 123 5.6. Estimación de los parámetros cinéticos de la ecuación de Michaelis-Menten………... 124 5.6.1. Determinación de las constantes cinéticas para la enzima inmovilizada en la membrana para soluciones de lactosa y permeado de suero de quesería………………… 125 5.6.2. Estimación de la constante de pérdida de actividad del biocatalizador…………… 127 5.7. Validación del modelo teórico…………………………………………….................... 127 5.8. Estudio del sistema bajo diferentes condiciones de operación………………………... 129 5.8.1. Curvas de Productividad…………………….…………………………………….. 130 5.8.1.1. Curvas de productividad en función de So y la presión a distintas 132 temperaturas……………….……………….……………….………………………….. 5.8.1.2. Curvas de productividad en función de So y la temperatura a distintas 133 presiones……………….……………….……………….……………….…………….. 5.8.2. Curvas de Conversión…………………….………………………..……………… 134 6. Conclusiones ……………………………………………………………………………... 137 6.1. Con respecto al modelo del flujo de permeado……………………………………….. 138 6.2. Con respecto a la inmovilización de la enzima en la membrana………….................... 138 6.2.1. Estabilidad térmica del biocatalizador...............…………………… …………….. 139 6.2.2. Con respecto a la estimación de los parámetros cinéticos………….……………... 139 6.3. Estabilidad Térmica del biocatalizador……………………………………………….. 140 6.3.1. Con respecto a la producción…………………....………………………………… 140 6.3.2. Con respecto a las conversiones….……………...………………………………... 140 iv Índice 6.3.3. Conclusión final del modelo………………………………………………………. 141 Anexo 1……………………………………………………………………………………… 142 A.1.1. Datos experimentales para la determinación de las constantes cinéticas para soluciones de lactosa………………………………….……………….…………………… 143 A.1.2. Datos experimentales para la determinación de las constantes cinéticas para permeado de suero de quesería………………………….……………….………………… 144 Anexo 2……………………………………………………………………………………… 145 A.2. Algoritmo para estimar las constantes cinéticas para soluciones de lactosa y permeado de suero de quesería…………………………………………………………….. 146 Anexo 3……………………………………………………………………………………… 148 A.3.1. Datos experimentales de caudal de permeación usando suero de quesería a 55°C… 149 A.3.2. Caudales iniciales a distintas temperaturas…………………………………………. 150 Anexo 4……………………………………………………………………………………… 151 A.4. Rutinas de cálculo en Matlab…………………………………………………………. 152 A.4.1. Rutina para graficar los flujos de permeado a distintas temperaturas y presiones para el tiempo total de operación……………………………….………………………... 152 A.4.2. Rutina para el cálculo de conversiones de lactosa………………………………... 153 A.4.3. Subrutina para cargar la ecuación diferencial que debe ser integrada…….……… 155 Anexo 5……………………………………………………………………………………… 157 A.5. Datos para validar el modelo matemático de Reacción-Concentración….................... 158 A.5.1. Condiciones experimentales……………………………………….……………... 158 A.5.2. Datos experimentales……………………………………………………………... 158 Anexo 6……………………………………………………………………………………… 159 Anexo 7……………………………………………………………………………………… 164 A.7.1. Rutina de MATLAB el cálculo de productividades……………………................... 165 A.7.2. Subrutina para cargar la ecuación diferencial que debe ser integrada….................... 166 Anexo 8…………………………………………………………………………………….... 167 A.8.1. Curvas de Productividad en función de So y la presión a distintas temperaturas………………………………………………………………………………... 168 A.8.2. Curvas de Productividad en función de So y la Temperatura a distintas presiones……………………………………………………………………….................... 168 Nomenclatura……………………………………………………………………………….. 170 Referencias Bibliográficas…………………………………………………………............. 174 v