Universidad del Turabo Diversidad ecológica de hongos filamentosos en la arena de las playas de la Costa Norte de Puerto Rico Por Lourdes Echevarría García B.S., Biología, Pontificia Universidad Católica de Puerto Rico M.S., Gerencia Ambiental, Manejo y Evaluación Riesgo Ambiental, Universidad Metropolitana de Puerto Rico Disertación Presentado a la Facultad de Ciencia y Tecnología en cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de Doctor en Filosofía en Ciencias Ambientales (Opción Biología) Gurabo, Puerto Rico mayo, 2016 UNIVERSIDAD DEL TURABO CERTIFICACIÓN DE APROBACIÓN DE DISERTACIÓN La disertación de Lourdes Echevarría García fue revisada y aprobada por los miembros del Comité de Disertación. El formulario de Cumplimiento de Requisitos Académicos Doctorales con las firmas de los miembros del comité se encuentra depositado en el Registrador y en el Centro de Estudios Graduados e Investigción de la Universidad del Turabo. MIEMBROS DEL COMITÉ DE DISERTACIÓN Mónica M. Arroyo, PhD Pontificia Universidad Católica de P.R. Asesora de investigación Teresa Lipsett, PhD Universidad del Turabo Supervisora Anastacio Emiliano, PhD Universidad del Turabo Miembro Ángel L. Rivera, PhD Universidad del Turabo Miembro Ligia Lebrón, PhD Universidad del Turabo Miembro © 2016 Lourdes Echevarría García. Todos los derechos reservados. Dedicatoria Quiero dedicar este trabajo de investigación, al igual que mi disertación, con mucho amor, a unas personas que siempre me han apoyado incondicionalmente en todas las metas que me he trazado en mi vida. A mi madre Josefina García, la cual me ayuda con mi hijo y las cosas en la casa y a mi hijo, Xavier Yamil Maldonado, que siempre me acompañó en el recorrido de tomar muestras, analizarlas y acompañarme a la universidad. Y por supuesto, al que me da energía, fortaleza y entusiasmo para continuar con cada proyecto de mi vida: a DIOS. Gracias a Él por brindarme la fuerza, paciencia, perseverancia y en todo momento actitud positiva. En todos los aspectos de la vida Él me guió para poder completar una de mis grandes metas, alcanzar el doctorado con éxito. iv Agradecimientos He tenido personas muy especiales que de una u otra forma me han ayudado durante todo el proceso de investigación y preparación de la disertación. A la Pontificia Universidad Católica, Recinto de Arecibo, por brindarme el espacio y equipos necesarios utilizando el laboratorio de Biotecnología para realizar los análisis de la investigación. A la Universidad del Turabo, que me brindó la oportunidad de ofrecer cursos en su Institución, ya que con ese dinero pude comprar los materiales de la investigación. A mis compañeros de trabajo de la PUCPR, el Prof. Juan Acevedo, por su aportación en la verificación de la identificación de los géneros y especies de las muestras. También al Prof. Víctor López y al Dr. Abner Colón por su asesoría y apoyo en la parte estadística y a la Dra. Mónica Arroyo por ayudarme con la parte de bioinformática y análisis molecular. A la Decana y miembro del comité, la Dra. Teresa Lipsett, por su incondicional ayuda y apoyo en todo el tiempo de estudios y a la Dra. Ligia Lebrón por todas sus sugerencias. v Índice Lista de tablas .................................................................................................................ix Listas de figura ...............................................................................................................xi Listas de apéndice ..........................................................................................................xiii Resumen ...........................................................................................................................xiv Abstract en inglés .............................................................................................................xvi Capítulo I Introducción ...................................................................................................1 1.1 Problema ........................................................................................................4 1.2 Justificación ...................................................................................................5 1.3 Hipótesis ........................................................................................................6 1.4 Objetivos del estudio......................................................................................7 Capítulo II Revisión de literatura ...................................................................................9 2.1 Marco legal ....................................................................................................9 2.2 Características de los hongos filamentosos....................................................9 2.3 Infecciones causadas por hongos filamentosos ..............................................13 2.4 Métodos moleculares de identificación de hongos filamentosos ...................14 2.5 Técnicas de identificación de ADN fúngico por PCR ...................................16 2.6 Análisis taxonómico.......................................................................................21 2.7 Análisis de hongos en arenas de diferentes playas del mundo ......................21 2.8 Estudios de contaminación microbiológicas en la playa ...............................30 Capítulo III Técnicas experimentales – Metodología .................................................33 3.1 Plan de investigación .....................................................................................33 3.1.1 Lugar de estudio ..............................................................................33 vi 3.1.2 Coordenadas de las payas estudiadas ..............................................33 3.2 Diseño experimental ......................................................................................33 3.2.1 Tiempo ............................................................................................33 3.2.2 Manejo y toma de muestras ............................................................33 3.2.3 Muestras para análisis molecular ....................................................34 3.2.4 Análisis (UFC) conteo de colonias y morfología ...........................35 3.2.5 Identificación del hongo filametoso................................................36 3.2.6 Análisis molecular: PCR .................................................................36 3.2.6.1 Extración de ADN............................................................36 3.2.6.2 Cuantificación ADN ........................................................36 3.3 Reacción en cadena de polimerasa (PCR) análsis de secuencia de ADN ......37 3.3.1 Secuencia “shotgun” de ADN .........................................................37 3.3.2 Secuencia del trascriptoma (ARN) .................................................37 3.3.3 Secuencia de ADNc ........................................................................37 3.3.4 Análisis de la secuenciación ...........................................................38 3.3.5 Árbol taxonómico ...........................................................................39 Capítulo IV Resultados y análisis ...................................................................................40 4.1 Géneros y especies identificadas por mes ......................................................40 4.2 Resultados de los controles ............................................................................40 4.3 Decripción del género Aspergillus .................................................................42 4.4 Descripción de género Penicillium ................................................................44 4.5 Descrpción del género Rhizopus ....................................................................46 4.6 Descripción del género Trichoderma.............................................................48 vii 4.7 Descripción del género Fusarium ..................................................................49 4.8 Descripción del género Hortaea ....................................................................52 4.9 Género y especies de hongos filamentosos en muestras de arena de playas analizadas morfológicamente .............................................................53 4.10 Datos de temperatura, humedad y UFC de las muestras mensuales ............61 4.11 Análisis inferencial de los datos ..................................................................63 4.12 Resultados de muestras de análisis molecular por temporada .....................69 4.13 Evaluación de riesgo ambiental ...................................................................116 Capítulo V Conclusiónes y recomendaciones ..............................................................120 Conclusiónes ...................................................................................................................120 Recomendaciones ...........................................................................................................126 Literatura citada ...........................................................................................................128 viii Lista de tablas Tabla 1.1 Diagnóstico dermatofitosis en P.R ..............................................................3 Tabla 1.2 Diagnóstico dermatomicosis en P.R. ..........................................................3 Tabla 2.1 Resumen de algunos hongos filamentosos identificados por técnicas moleculares .................................................................................................17 Tabla 2.2 Primer, secuencias y objetivos genómicos para hongos filamentosos .......20 Tabla 3.1 Información de latitud y longitud de cada playa .........................................33 Tabla 4.1 Género y especies de hongos filamentosos identificados por mes en las cuatro playas en todo el año ........................................................................41 Tabla 4.2 Especies de hongos del género Aspergillus identificados...........................43 Tabla 4.3 Especies de hongos del género Penicillium identificados ..........................45 Tabla 4.4 Especies de hongos del género Rhizopus identificados ..............................47 Tabla 4.5 Especies de hongos del género Trichoderma identificados ........................49 Tabla 4.6 Especies de hongos del género Fusarium identificadas .............................52 Tabla 4.7 Especies de hongos del género Hortaea identificado ................................53 Tabla 4.8 Resultados prueba de normalidad ...............................................................64 Tabla 4.9 Resultados prueba de Kruskal Wallis #1 ....................................................64 Tabla 4.10 Resultados Prueba de rangos de Kruskal Wallis #1 ....................................65 Tabla 4.11 Resultados prueba de Kruskal Wallis #2 ....................................................65 Tabla 4.12 Resultado prueba de rangos de Kruskal Wallis #2......................................66 Tabla 4.13 Resultados prueba de Mann-Whitney #1.....................................................67 Tabla 4.14 Rangos prueba de Mann-Whitney #1 .........................................................67 ix Tabla 4.15 Resultados prueba de Mann-Whitney #2.....................................................68 Tabla 4.16 Rangos prueba de Mann-Whitney #2 ..........................................................68 Tabla 4.17 Resultados Prueba de Mann-Whitney #3 ....................................................69 Tabla 4.18 Rangos prueba de Mann-Whitney #3 ..........................................................69 Tabla 4.19 Especies de hongos que se encontraron en la playa Caza y Pesca, en Arecibo: comparación temporada húmeda, en común y temporada seca .........................................................................................71 Tabla 4.20 Especies de hongos filamentosos en la playa Marbella, Vega Baja: comparación temporada húmeda, en común y temporada seca ..................74 Tabla 4.21 Especies de hongos filamentosos en la playa Las Criollas, Barceloneta: comparación temporada húmeda, en común y temporada seca ..................77 Tabla 4.22 Especies de hongos filamentosos en la playa Los Tubos, Manatí: comparación temporada húmeda, en común y temporada seca ..................80 Tabla 4.23 Especies encontradas en la época húmeda en las cuatro playas .................83 Tabla 4.24 Especies encontradas en la época seca en las cuatro playas .......................85 Tabla 4.25 Especies predominantes por temporada, playa, tax ID ..............................87 Tabla 4.26 Especies más abundantes y su patogenicidad .............................................88 Tabla 4.27 Géneros más abundantes y su conteo..........................................................89 Tabla 4.28 Total de especies por muestras de cada estación por playa ........................91 Tabla 4.29 Hongos identificados en muestra de arena (ADN): sustrato, patogenicidad y enfermedad que causa.......................................................96 x