UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID Facultad de Medicina Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia COMUNICACIÓN ENTRE NEURONAS Y ASTROCITOS MEDIADA POR ENDOCANNABINOIDES Tesis Doctoral Marta Navarrete Llinás Madrid, 2009 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID Facultad de Medicina Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia COMUNICACIÓN ENTRE NEURONAS Y ASTROCITOS MEDIADA POR ENDOCANNABINOIDES Tesis Doctoral Marta Navarrete Llinás Madrid, 2009 CONSEJO SUPERIOR MINISTERIO DE INVESTIGACIONES DE CIENCIA CIENTÍFICAS E INNOVACION Instituto de Neurobiología “Ramón y Cajal” Dr. Alfonso Araque Instituto Cajal, CSIC Doctor Arce 37, Madrid 28002 Tel: 91 585 4710 Fax: 91 585 4754 E-mail: [email protected] Dr. Alfonso Araque Almendros, Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas en el Instituto Cajal, HACE CONSTAR: Que Dña. Marta Navarrete Llinás ha realizado bajo mi dirección los trabajos de investigación destinados a la obtención del grado de Doctora en el Instituto Cajal (CSIC), cuyos resultados están recogidos en la presente memoria de Tesis Doctoral titulada “Comunicación entre Neuronas y Astrocitos mediada por Endocannabinoides”. Y para que conste y surta los efectos oportunos, lo firmo en Madrid a 1 de Abril de 2009, Dr. Alfonso Araque Profesor de Investigación del CSIC Avda Doctor Arce 37 28002 Madrid ESPAÑA Telf. 91 5854750 Fax.: 91 5854754 A la memoria de mi Padre A mi Madre AGRADECIMIENTOS En primer lugar quiero agradecer a todas aquellas personas que de una u otra forma han contribuido a la realización de este trabajo. Para mí la Tesis no es sólo este libro, sino que es cada minuto que durante estos años he compartido con todos vosotros. Empecé estando aún en la facultad, gracias al apoyo del Dr. Joaquín Espinosa, el cual me deslumbró con sus majestuosas lecciones de Química Cuántica. Fue en este laboratorio donde viví mis peores momentos personales, pero tuve la gran suerte de estar al lado de un segundo padre, que es lo que fue él para mí. Joaquín y Cipri, a quienes les debo un agradecimiento mayúsculo por muchos motivos, entre ellos, porque fueron los primeros en enseñarme la pasión por la Ciencia. Añorando mi bata blanca cambié a un laboratorio en donde se investigaban los astrocitos, y yo pensé “¿y eso qué será?”. Fue el Dr. Alfonso Araque quien confió en mí, aún sabiendo que teníamos mucho camino que recorrer, y me dio la oportunidad de conocer la ciencia del primer mundo. Quiero expresar mi agradecimiento más sincero a Alfonso por toda la aportación humana y científica que me ha brindado. Gracias por hacerme ver que la ciencia, y en concreto la electrofisiología, puede ser un mundo apasionante. ¿Quién diría en mis comienzos que me gustaría cambiar cables y no ponerme una bata blanca? Gracias por enseñarme tus mayores principios: El principio de incertidumbre de los mundos de Araque, la dieta Araque, la noche Araque, al Club de fans de Araque, la campaña de motivación de Araque (sin plumas), la sabiduría de Araque. Ya ahora el Profesor Araque era, es, siempre será un referente donde fijarme. A Gertru Perea, porque sin ella este trabajo no hubiese sido posible. No sé cómo se puede agradecer tanto a una persona, sus excelentes lecciones de seguridad, su optimismo en el trabajo, su paciencia y su comprensión. Gracias por convencerme de que la ciencia es un juego y que lo importante es participar. Creo por ello, que le tendría que dar las gracias a la ciencia por darme la oportunidad de conocer a Gertru, donde además de compañera la considero amiga. Gracias por ayudarme en mis malos momentos, vale, que han sido muchos, pero sin ti no hubiese sido capaz de superarlos, y ya sabes nuestro lema: “Ánimo pequeña”. A Whasington Buño, a quien admiro por su generosidad, por su pasión por la investigación, pos su sabiduría y sus ganas de aprender. Gracias por endulzarnos la hora taller con chocolate. A todo el A-15-17, Marco, David, Carolina y Sol a quienes no sólo me han dejado un trozo de su laboratorio, sino también he disfrutado de su amistad. Para mi ha sido realmente especial haber compartido con vosotros todo este tiempo. A mi Tutor, Ángel Núñez, por hacernos esos Martes tan amenos, por ayudarnos tantas veces con la sufrida burocracia universitaria y por supuesto a su alegría. A Nueva York, porque marcó un antes y un después en mi Vida. A Alberto Pereda quien me brindó la oportunidad de conocer no sólo una gran ciudad sino también por poder ver una ciencia diferente en un país diferente. Al rilí, incrí, dipolaraix, ther… que marcó mi vida como científica (o algo parecido), al frente de liberación astrocitaria (FLA) y a un sin fin de recuerdos. A todos mis amigos, por sus ganas de conocer qué demonios está investigando esta loca ahora. A Jorge y Leyre, por ayudarme con esas técnicas tan diferentes para mí y a Laura, que tiñó con un aire Argentino los últimos coletazos de esta Tesis. A Eduardo, por su característico humor picante. A Raúl, por su heroica paciencia, su ambulancia particular, los Martes de Café, las comidas tertulianas. Al Instituto Cajal en general. Y por último, dos agradecimientos especiales: A mi Familia, y en especial a mi Padre, a ti “Canete”, que aunque la maldita ciencia no me dio la oportunidad de despedirme de ti, ahora me ofrece la ocasión de dedicarte uno de nuestros mayores sueños. Sé que en los malos momentos siempre estabas en algún lugar para darme buenos consejos y en los buenos, estabas para disfrutarlos como el que más. A mi Madre, quien nunca perdió la fe en mi y de quien aprendí que todo tiene su parte positiva “siempre tiene una sonrisa para nosotros”. A los Víctors, Emilia y Juanjo a quienes les agradezco toda su confianza puesta en mí. Ellos fueron mi principio y a ellos les debo todo. A ti Vicente, por todo: Tu no comprensión y tu paciencia, tus tardes de soledad (que ya me gustarían a mi), tu alegría, tu confianza en mi, tus ambiciones (contagiosas), por todo… Porque en pocas palabras se pueden decir muchas cosas, en Octubre te diré la palabra más importante de nuestras vidas… Por nuestros sueños. Cuando despertó, el dinosaurio todavía estaba allí. Augusto Monterroso. Razonar y convencer, ¡qué difícil, largo y trabajoso! ¿Sugestionar? ¡Qué fácil, rápido y barato! Santiago Ramón y Cajal Portada: ‘Gruesa célula neuróglica de la capa de las pirámides del asta de Ammón del hombre adulto.-A, grandes vacuolas del soma; a, b, huecos de las expansiones destinados á los gliosomas’. Dibujo original de S. Ramón y Cajal, conservado en el Museo Cajal. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1. Antecedentes en el estudio de las células de glía 5 2. El ión calcio como base de la excitabilidad celular de los astrocitos 6 3. La sinapsis tripartita 9 3.1 Comunicación neurona-astrocito. Los astrocitos responden a la actividad sináptica 9 3.2 Comunicación astrocito-neurona. Participación de los astrocitos en la fisiología neuronal 11 4. Sistema endocannabinoide 13 4.1 Expresión de receptores de cannabinoides CB1 por astrocitos 15 II. OBJETIVOS 19 III. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Obtención y preparación de rodajas de hipocampo de ratón 23 2. Registros electrofisiológicos 23 3. Estimulación de axones 3.1. Estimulación eléctrica convencional 24 3.2. Estimulación eléctrica mínima 25 4. Imagen de Ca2+ intracelular. 26 5. Foto-estimulación de neuronas 28 6. Inmunocitoquímica 28 7. Agentes Farmacológicos 29 8. Análisis de datos 30 IV. RESULTADOS 1. Los astrocitos expresan receptores funcionales CB1 33 2. Los astrocitos responden con aumentos intracelulares de Ca2+ a la despolarización neuronal 37 3. Endocannabinoides procedentes de neuronas piramidales de CA1 provocan elevaciones de Ca2+ en astrocitos 41 4. Consecuencias de las elevaciones de Ca2+ astrocitarias en la excitabilidad neuronal. 4.1. Las elevaciones de Ca2+ mediadas por receptores CB1 en astrocitos generan corrientes lentas de entrada debidas a glutamato en neuronas piramidales 46 5. Consecuencias de las elevaciones de Ca2+ astrocitarias sobre la transmisión sináptica excitadora. 5.1. Las elevaciones de Ca2+ mediadas por receptores CB1 en astrocitos provocan una potenciación transitoria de la transmisión sináptica excitadora 50 5.2. La potenciación sináptica requiere del aumento de Ca2+ astrocitario 55 5.3. La potenciación sináptica inducida por endocannabinoides está mediado por los receptores mGlu de tipo I 59 5.4. La potenciación sináptica inducida por endocannabinoides es mediada por activación de proteínas G no sensibles a toxina pertúsica 60 5.5. La modulación sináptica inducida por endocannabinoides no depende de la expresión diferencial de receptores de CB1 sino de rutas específicas de señalización intercelular 61 5.6. Endocannabinoides inducen depresión homosináptica y potencia- ción heterosináptica 62 V. DISCUSIÓN 67 VI. CONCLUSIONES 75 VII. REFERENCIAS 79 VIII. SEPARATA 91