Uloga proupalnih i protuupalnih mehanizama u razvoju rezistencije posredovane ABC transporterima u upalnim bolestima crijeva Savić Mlakar, Ana Doctoral thesis / Disertacija 2015 Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: University of Zagreb, Faculty of Science / Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet Permanent link / Trajna poveznica:https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:827987 Rights / Prava:In copyright / Zaštićeno autorskim pravom. Download date / Datum preuzimanja:2023-03-16 Repository / Repozitorij: Repository of the Faculty of Science - University of Zagreb PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET BIOLOŠKI ODSJEK Ana Savić Mlakar ULOGA PROUPALNIH I PROTUUPALNIH MEHANIZAMA U RAZVOJU REZISTENCIJE POSREDOVANE ABC TRANSPORTERIMA U UPALNIM BOLESTIMA CRIJEVA DOKTORSKI RAD Zagreb, 2015. FACULTY OF SCIENCE DIVISION OF BIOLOGY Ana Savić Mlakar THE ROLE OF PROINFLAMMATORY AND ANTI-INFLAMMATORY MECHANISMS IN DEVELOPMENT OF ABC TRANSPORTER MEDIATED RESISTANCE IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASES DOCTORAL THESIS Zagreb, 2015. Ovaj je doktorski rad izrađen na Imunološkom zavodu d.d., Odjel za istraživanje i razvoj, Odsjek za celularnu imunologiju, Zagreb, Hrvatska, pod vodstvom dr.sc. Ivne Svobode- Beusan i dr.sc. Kreše Bendelje, u sklopu Sveučilišnog doktorskog studija Biologije na Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. ZAHVALA Zahvaljujem svim zaposlenicima Odjela za istraživanje i razvoj Imunološkog zavoda, koji su pomogli u izvršavanju ovog istraživanja. Veliko hvala mojim mentorima na savjetima i stpljenju, te svim liječnicima i osoblju u suradničkim kliničkim ustanovama koji su sudjelovali u prikupljanju uzoraka i kliničkih podataka. Zahvaljujem i svojim roditeljima, bratu i baki na podršci i razumijevanju. Ovu disertaciju posvećujem svojoj obitelji, Mariu i Gabrielu, koji su mi najveća podrška i inspiracija. Ana Savić Mlakar Sveučilište u Zagrebu Doktorski rad Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek ULOGA PROUPALNIH I PROTUUPALNIH MEHANIZAMA U RAZVOJU REZISTENCIJE POSREDOVANE ABC TRANSPORTERIMA U UPALNIM BOLESTIMA CRIJEVA ANA SAVIĆ MLAKAR Ovaj rad izrađen je na Imunološkom zavodu, Zagreb, Hrvatska SAŽETAK ABC transporteri sudjeluju u očuvanju crijevne barijere, te utječu na biodostupnost lijekova. Promjene njihove ekspresije mogu doprinijeti narušavanju barijere i razvoju upale, kao što je slučaj u upalnim bolestima crijeva. Njihova uloga u patogenezi upalnih bolesti crijeva nije u potpunosti razjašnjena. U ovom istraživanju odredili smo ekspresiju triju transportera: MDR1, MRP1 i BCRP, kod odraslih i djece oboljele od Crohnove bolesti (odrasli; n=25, djeca; n=26) i ulceroznog kolitisa (odrasli; n=27, djeca; n=20). Paralelno smo odredili i ekspresiju proupalnih citokina interferona (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, IL-6, IL-1β i IL-17A, kao i njihove negativne regulatore, SOCS1 i SOCS3. Ispitanici su podijeljeni u četiri grupe: neliječeni bolesnici dijagnosticirani de novo, grupa bolesnika pod terapijom, te grupa u remisiji odnosno grupa zdrave kontrole (odrasli; n=10, djeca; n=15). Ovo istraživanje pokazuje izmijenjene ekspresije transportera koji koreliraju s povišenim ekspresijama citokina u oboljelih ispitanika. Nadalje, povišena ekspresija proupalnih citokina, popraćena povišenim ekspresijama njihovih negativnih regulatora, potvrđuju upalni proces kao dominantni patološki mehanizam u upalnim bolestima crijeva. Dakle, promjene ekspresija ABC transportera mogle bi imati funkcionalnu važnost u progresiji bolesti i liječenju. Ključne riječi: ABC transporteri; Crohnova bolest; Ulcerozni kolitis; citokini; supresori citokinske signalizacije Mentori: dr.sc. Ivna Svoboda-Beusan i dr.sc. Krešo Bendelja Ocjenjivači: prof.dr.sc. Nada Oršolić, prof.dr.sc. Branko Troskot, prof.dr.sc. Maja Matulić University of Zagreb Doctoral thesis Faculty of Science Division of Biology THE ROLE OF PROINFLAMMATORY AND ANTI-INFLAMMATORY MECHANISMS IN DEVELOPMENT OF RESISTANCE MEDIATED BY ABC TRANSPORTERS IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASES ANA SAVIĆ MLAKAR This work has been performed at the Institute of immunology, Zagreb, Croatia ABSTRACT Efflux transporters are crucial for the maintenance of gut homeostasis and influence drug bioavailability. Changes in their expression can disrupt the barrier which consequently results with inflammatory response, as observed in inflammatory bowel diseases (IBD). Their exact role in IBD pathogenesis is inconclusive. We have measured the expression of transporeters MDR1, MRP1 and BCRP in pediatric and adult patients with Crohn's disease (adults; n=25, pediatric; n=26) and ulcerative colitis (adults; n=27, pediatric; n=20). In paralell, we have assessed the expression of inflammatory cytokines IFN-γ , IL-2, IL-6, IL-1β and IL-17A, as well as their negative regulators, SOCS1 and SOCS3. Subjects were grouped as: newly diagnosed/untreated, active disease/treated, remission and controls (adults; n=10, pediatric; n=15). We showed that altered expression of efflux transporters correlated with cytokine expressions in IBD patients compared to controls. Furthermore, high cytokine expression, followed by high expression of their matched negative regulators, confirmed inflammatory process as the dominant pathological mechanism in IBD. In conclusion, alterations in ABC transporter expression could have functional importance in disease progression and treatment. Keywords: ABC transporters; Crohn's disease; Ulcerative colitis; cytokines; suppressors of cytokine signalling Supervisors: Ivna Svoboda-Beusan, Ph.D. and Krešo Bendelja, Ph.D. Reviewers: Professor Nada Oršolić, Ph.D., Associate Professor Branko Troskot, Ph.D., Associate Professor Maja Matulić, Ph.D. SADRŽAJ 1. UVOD……………………………………………………………………………........1 2. LITERATURNI PREGLED…..………………………………………………….…...2 2.1. UPALNE BOLESTI CRIJEVA…………………………………………..……....2 2.2. EPIDEMIOLOGIJA UPALNIH BOLESTI CRIJEVA………...………………....4 2.3. ETIOLOGIJA UPALNIH BOLESTI CRIJEVA …………………………………5 2.3.1. Okolišni čimbenici………………………………..……………………….5 2.3.2. Imunosni čimbenici………………………………………………………..5 2.3.3. Genetički čimbenici……………...………………………….......................7 2.4. CITOKINI I MOLEKULE SOCS ……………… ……………………….….…...7 2.4.1. Interleukin-6………………………………………………………….……8 2.4.2. Interferon gama……………………………………………………..….….9 2.4.3. Interleukin-1 beta……………………..…………………………………...9 2.4.4. Interleukin-17A…………………………………………………………..10 2.4.5. Interleukin-2………………………………………………………….…..10 2.4.6. SOCS1…………………………………………………………………....11 2.4.7. SOCS3………………………………………………………………...….12 2.5. LIJEČENJE UPALNIH BOLESTI CRIJEVA …………...……..........................12 2.6. VIŠESTRUKA REZISTENCIJA NA LIJEKOVE…………………………...…13 2.7. ABC TRANSPORTERI…………………………………………………..….….14 2.7.1. Struktura ABC transportera………………………………………….…...15 2.7.2. Mehanizam izbacivanja supstrata…………………………………….…..16 2.7.3. MDR1………..………………………………………………………...…17 2.7.4. MRP1……….…………………………………………………………....20 2.7.5. BCRP……….............................................................................................20 3. OBRAZLOŽENJE TEME I HIPOTEZA....................................................................22 4. MATERIJALI I METODE..........................................................................................23 4.1. Ispitanici i uzorci...................................................................................................23 4.2. Stabilizacija tkiva..................................................................................................24 4.3. Homogenizacija tkiva…………………………………………………………....24 4.4. Izolacija ukupne RNA...........................................................................................25 4.5. Reverzna transkripcija RNA.............................................................................. ...25 4.6. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze............................................................26 4.7. Statistička obrada podataka...................................................................................27 5. REZULTATI................................................................................................................29 5.1. Karakteristike ispitanika........................................................................................29 5.2. Ekspresija ABC transportera………………………………………………..…...32 5.2.1. Ekspresija ABC transportera kod odraslih………………...……….....….32 5.2.2. Ekspresija ABC transportera kod djece…………………………….….....34 5.3. Odnos ekspresija ABC transportera između oboljelih od upalnih bolesti crijeva i zdravih ispitanika………………………...……………………………………....35 5.3.1. Analiza ekspresije ABC transportera kod odraslih…...………………….35 5.3.2. Analiza ekspresije ABC transportera kod djece………………………….38 5.4. Odnos ekspresija citokina i molekula SOCS između oboljelih od upalnih bolesti crijeva i zdravih ispitanika……………………………………………………….41 5.4.1. Analiza ekspresije citokina i molekula SOCS kod odraslih…………..….41 5.4.2. Analiza ekspresije citokina i molekula SOCS kod djece………………...44 5.5. Praćenje tijeka liječenja bolesnika s ulceroznim kolitisom……………...…........49 5.5.1. Slučaj 1…………………………………………………………….….…50 5.5.2. Slučaj 2......................................................................................................51 6. RASPRAVA................................................................................................................54 7. ZAKLJUČAK..............................................................................................................66 8. LITERATURA.............................................................................................................67 9. ŽIVOTOPIS……………………………………………………………………….....92 10. PRILOG 1: -POPIS KRATICA……………………………………………………...93