UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES EN ALIMENTOS ALTAMENTE AZUCARADOS TESIS DOCTORAL ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA MARZO 1999 23246 DIOLIOrECA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES EN ALIMENTOS ALTAMENTE AZUCARADOS Memoria presentada por ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA para optar al grado de 1119DIIUHUU3U Doctor en Ciencias Biológicas s309 ssO7~ UNIVERSIDADCOMPLUTENSE 12- U*S2 11-o )C Esperanza Casas 0 B0 la Directora del trabajo y AAh -Ni Dra. M~ José Valderrama Conde MARZO 1999 Este trabajo ha sido financiado gracias a la ayuda recibida de la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología, y los proyectos MR CT 93 08030 (europeo) y DGICYT UE 96-0018 (Comunidad de Madrid). INDICE Página 1.- INTRODUCCIÓN 1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos 2 1.2.- Alimentos altamente azucarados y microorganismos osmotolerantes 4 1.2.1.- Adaptación de las levaduras a altas concentacione~ de azúcar 7 1.3.- Los sorbatos como conservantes 10 1.3.1.- Mecanismos de actividad antimicrobiana del sorbato 11 1.3.1.1.- Alteraciones morfológicas 12 1.3.1.2.- Alteraciones en la función metabólica 12 1.3.2.- Resistencia de los microorganismos al sorbato 14 1.3.3.- Aplicaciones del sorbato 19 1.4.- Identificación de levaduras 20 1.4.1.- Esporulación 23 II.- OBJETIVOS DEL TRABAJO 27 30 III.- MATERIALY MÉTODOS 31 111.1.- Muestras y alteraciones 35 111.2.- Alsíamiento de microorganismos 38 111.3.- Mantenimiento de las cepas 38 111.4.- Identificación de levaduras 42 111.4.1.- Esporulación “44 111.5.- Identificación de hongos filamentosos 45 111.5.1.- Identificación de Aspergillus 46 111.5.2.- Identificación de Penicilliunz 48 111.6.- Reproducción de las alteraciones t 48 111.6.1.- Reproducción del olor a ‘petróleo 111.6.2.- Reproducción de las licuefacciones puntuales 48 111.6.2.1.- Reproducción in siw 48 111.6.2.2.- Reproducción en medios experimentales 48 111.7.- Estudio del mecanismo de licuefacción 49 1 111.8.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del ácido sórbico 50 111.9.- Caracterización del compuesto responsable del olor a petróleo’ 51 111.9.1.- Identificación de 1,3-pentadieno 51 111.9.2.- Cuantificación de la producción de pentadieno a partirde sorbato 53 . 111.9.2.1.- Cuantificación de sorbato en los medios 54 111.9.2.1.1.- Extracción y preparación de las muestras 54 111.9.2.1.2.- Condiciones de HPLC 55 111.9.2.1.3.- Cuantificación de sorbato 56 111.9.2.1.4.- Estudio de recuperación 56 111.9.2.2.- Cuantificación de pentadieno en los medios 56 111.9.2.3.- Determinación de biomasa 58 111.10.- Prueba estandarizada para la reproducción del olor a “petróleo” 58 IV.- RESULTADOS 60 IV.1.- Microorganismos aislados e identificación 61 .. . IV.1.1.- Levaduras 61 IV.l.2.- Hongos filamentosos 76 IV.2.- Esporulación en cepas representativas 86 IV.3.- Reproducción de las alteraciones 90 IV.3.l.- Reproducción del olor a ‘petróleo’ yio gas 90 IV.3.2.- Reproducción de las licuefacciones puntuales 93 IV.3.2.1.- Reproducción iii situ 94 IV.3.2.2.- Reproducción en medios experimentales 94 IV.4.- CMI de ácido sórbico para cepas seleccionadas 97 t’petróleo” 97 IV.5.- Identificación del compuesto responsable del olor a IV.6.- Cuantificación de pentadieno producido a partir de sorbato 105 IV.6.l.- Cuantificación de sorbato 105 IV.6.l.l.- Recuperación de sorbato en los medios sin inocular 106 IV.6.1.2.- Determinación de sorbato en los medios inóculados 108 IV.6.2.- Cuantificación de pentadieno 110 IV.6.3.- Recuentos celulares 112 11 V.- DISCUSIÓN 114 V.l.- Caracterización de microorganismos aislados 115 V.l.1.- Levaduras 115 V.1.2.- Hongos filamentosos 127 V.2.- Esporulación 131 V.3.- Reproducción de las alteraciones 138 V.3.1.- Reproducción del olor a petróleo’ y/o gas 138 V.3.2.- Reproducción de las licuefacciones puntuales 143 .... V.4.- CMI de ácido sórbico para cepas seleccionadas 146 V.5.- Identificación de pentadieno como compuesto responsable del olor a ‘petróleo 148 u V.5.1.- Cuantificación de sorbato 155 V.5.2.- Producción de pentadieno 156 ¡ V.5.3.- Recuentos celulares 157 V.6.- Prueba estandarizada 159 u VI.- CONCLUSIONES 160 ¡ VII.-BIBLIOGRAFLA. 163 ¡ VIII.- APÉNDICES 178 E Apéndice 1.- Medios de cultivo 179 Apéndice II.- Nombres actuales de levaduras 188 ¡ ¡ 3 ¡ 3 u u 111 u u ¡ ¡ 3 ¡ u ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ 3 ¡ 3 ¡ u ¡ ¡ L- INTRODUCCiÓN ¡ u u L- Introducción 1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos Aunque las levaduras son conocidas fundamentalmente por sus beneficios, tales como la tradicional aplicación en la fabricación del vino, la cerVeza o el pan, su papel como agentes responsables del deterioro en alimentos ofrece en la actualidad un amplio campo de estudio. Las levaduras soncapacesde creceren un variado conjunto de alimentos bajo determinadas condiciones, lo que puede llegar a suponer importantes pérdidas económicas en ciertos sectores industriales. Entre estas condiciones que favorecen -e incluso seleccionan- el crecimiento de las levaduras, destacan cuatro factores que pueden actuar de forma sinérgica: baja actividad de agua (a~) -es decir, cantidad de agua del alimento disponible para la actividad metabólica de los microorganismos-, bajo pH, bajas temperaturas y la presencia, normalmente por adición, de agentes antibacterianos (Tudor y Board, 1993). De esta forma, aquellos alimentos que posean una o más de estas características serán susceptiblesde contaminación y deterioro por levaduras. Así, se conocen alteracionesdebidas a levaduras contaminantes en alimentos como zumos defrutas y refrescos, bebidas alcohólicas, alimentos altamente azucarados, verduras, alimentos fermentados o conservados en ácido, productos lácteos y de panadería, o carnes y pescados (Fleet, 1992; Deak y Beuchat, 1996). Las principales especies de levadura asociadas con el deterioro de estos productos se especifican en la Tabla 1. Respecto ala alteración producida porlevaduras, una primeramanifestación puede ser la formación de biomasa, que es especialmente evidente cuando la levadura es pigmentada, como es el caso de Rhodotorula spp.; en líquidos, la aparición de biomasa se detecta por la aparición de turbidez. Cuando la presencia de biomasa queda enmascarada porel propio alimento, la alteración puede deberse a los productos del metabolismo de las levaduras; entre éstos, cabe destacar la formación de gas -CO 2-, que distorsiona la forma de los envases y/o los propios productos, y la aparición de diversos olores y sabores de fondo, provocados por la formación de alcoholes, ácidos orgánicos y ésteres (Fleet, 1992; Tudor y Board, 1993). 2 U Introducción Tabla 1.- Principales especies de levaduras responsables de deterioro, por orden alfabético, y alimentos de los que se han aislado Especie de levadura Alimentos alterados Salmueras, carnes fermentadas y curadas, zumo de Debaryomyces hansenii naranja, leche, helado, nata, queso, yogur, pan, marisco Dekkera intermedia Cerveza, vino, refrescos, yogur Issarchenkia orientalis Leche, queso, yogur, salsa de tomate Kloeckera apiculata Tomates, higos, cerezas en lata, yogur Pichia membranzfaciens Salmuera de aceitunas, conservas en vinagre, salsa de tomate, queso, carnes Rhodotorula spp. Frutas tratadas térmicamente, nata, mantequilla, helado, yogur, pan, carnes, marisco Saccharomyces cerevisiae Refrescos, zumos de frutas, queso, yogur, pan Saccharomyces exiguus Refrescos, carnes, marisco, chucrut Schizosaccharomyces pombe Jarabes de azúcar Zygosaccharomyces bailii, Zumos concentrados y jarabes de fruta, vino, salsa de Zygosaccharomyces bisporus tomate, mayonesa, pan Zygosaccharomyces rouxii Jarabes concentrados, zumos de fruta, rellenos de pastelería, mazapán, ciruelas e higos, mayonesa, marisco Modificado de Tudor y Board (1993. 3 L- Introducción ¡.2.- Alimentosaltamente azucarados y microor2anismos osniotolerantes Los productos altamente azucarados se incluyen dentro de un amplio grupo de alimentos que se denominan de humedad intermedia, conocidos por sus siglas en inglés como IMF’s (Intermediate Moisture Foods) (Tilbury, 1976; Deak y Beuchat, 1996). Se consideran alimentos de humedad intermedia a aquéllos que poseen un contenido en agua entre 15 y 20 y una a~ con valores entre 0,60 y 0,85. Este ténnino engloba a muchos alimentos sometidos a la adición de azúcar o sal, secado o curado, tratamientos que conducen auna mejor conservación de losproductos, debidoal hecho bien conocido de que disminuyendo la a~ mediante secado o adición de solutos, se puede retardar e incluso inhibir el crecimiento microbiano. La Tabla 2 muestra algunos grupos de alimentos azucarados incluidos como alimentos de humedad intermedia atendiendo a las características de humedad y a.~ previamente descritas. Tabla 2.- Principales productos azucarados de humedad intermedia, junto con su humedad y su actividad de agua Actividad Humedad Tipo de producto Ejemplos ( p/p) de agua (av) Azúcares, jarabes, Azúcar sin refinar 0,4-0,7 0,60-0,75 conservas Jarabes de azúcares; azúcar invertido 20-36 0,70-0,86 Miel, compota, mermelada 20-35 0,63-0,80 Concentradosde zumos Zumo de frambuesa 35 0,79-0,80 de frutas Zumo de naranja 35 0,80-0,84 Zumo de manzana 0,71-0,75 Productos de confitería Caramelos y toifees 8 0,60-0,65 y repostería Mazapán 15-17 0,67-0,80 Cerezas glaseadas 30 0,75 Pasteles de frutas 20-28 0,73-0,83 Chocolate Relleno de chocolate 0,64 Frutas desecadas Ciruelas, higos 20 0,68 Dátiles 12-25 0,60-0,65 datos no especificados. - — Modificadode Tilbury (1976), Jermini et al. (1987) y Tudor y Board (1993). 4