UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS SANTE, SCIENCES, TECHNOLOGIE ÉQUIPE de RECHERCHE : « FOLLICULE, OVOCYTE ET DEVELOPPEMENT », UNITE PHYSIOLOGIE DE LA REPRODUCTION ET DES COMPORTEMENTS, INRA THÈSE présentée par Christine CHABROLLE soutenue le 28 Novembre 2008 pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie / Reproduction-Ecologie EXPRESSION, REGULATION ET ROLE DU SYSTEME ADIPONECTINE DANS L’OVAIRE CHEZ TROIS ESPECES THÈSE dirigée par : Madame DUPONT Joelle Chargée de Recherche, HDR, Université François-Rabelais, Tours RAPPORTEURS : Monsieur FEVE Bruno Directeur de Recherche, INSERM, Paris-Sud XI Madame MAGRE Solange Sous-Directeur, Collège de France, Paris JURY : Madame DUPONT Joëlle Chargée de Recherche, HDR, INRA, Tours Monsieur FEVE Bruno Directeur de Recherche, INSERM, Paris-Sud XI Monsieur LECOMTE Pierre Professeur, Université François-Rabelais, Tours Madame MAGRE Solange Sous-Directeur, Collège de France Monsieur ROYERE Dominique Professeur, Université François-Rabelais, Tours Monsieur YOUNG Jacques Professeur, Paris-Sud XI 1 Remerciements Ce travail a été réalisé dans l’Unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements de l’UMR 6175 INRA-CNRS-Université Rabelais de Tours, à Nouzilly, sous la direction de Joëlle Dupont de 2005 à 2008. Je remercie: Madame Joëlle Dupont pour l’accueil au sein de son laboratoire. Son encadrement, son soutien, sa disponibilité sont sans faille et toujours accompagnés d’une grande motivation. Avec Joelle, tous les sujets sont dignes d’intérêt et tous les résultats sont des résultats !! Je pourrais sans doute être intarissable sur les qualités professionnelles de Joelle Dupont mais je préfère lui dire merci pour cette part d’humanité qu’elle cache si bien ! Pour tout cela, sincèrement MERCI ! Mesdames, Messieurs, Solange Magre, Bruno Feve, Pierre Lecomte, Dominique Royère et Jacques Young pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse. Un merci «tout particulier» à Monsieur le Professeur Lecomte pour m’avoir guidée dans cette voie même si «le cap» n’est pas toujours facile à maintenir. Merci de m’avoir montré qu’il ne faut jamais abandonner. Je remercie Monsieur le professeur Royère de sa collaboration au cours de ma dernière année de thèse. 2 Je remercie l’ensemble de l’équipe INRA de son accueil au sein de l’Unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements. Merci pour les réunions, les discussions et les conseils scientifiques. Je voudrais remercier tout particulièrement Madame Danielle Monniaux et Monsieur Philippe Monget qui m’ont permis de rencontrer Joelle Dupont. Sans votre disponibilité ce jour là, rien n’aurait été possible. Merci à toutes les personnes qui ont croisé ma route pendant ces trois années dans l’équipe « Follicule, Ovocyte et Développement » … Lucie, merci pour ta présence, ton soutien et ton écoute pendant ces deux années communes : comment oublier notre co-voiturage pratique et si réconfortant !! Nouzilly semble parfois si loin! Merci à Patricia Solnais pour son accompagnement dans les débuts de mes travaux. Merci à Christelle Ramé pour son aide technique, sa gentillesse et sa disponibilité. Un grand merci à Eric Jeanpierre pour son humour et son « grand cœur ». Enfin, merci à Svetlana, Thierry, Martine, Amélie, Barbara, Juan… …mais aussi au niveau de l’Unité de la Recherche Avicole et plus particulièrement l’équipe de Madame Sophie Tesseraud. 3 Je souhaiterais remercier Messieurs les Professeurs Dominique Perrotin, Loic de Calan et Christian Andrès pour le soutien qu’ils m’ont apporté au cours de ce projet. Je voudrais remercier toute l’équipe médicale de médecine B, Messieurs les professeurs Guilmot et Lecomte, Mesdames les docteurs Marie Castric, Elisabeth Diot, Nicole Ferreira- Maldent, Julie Magnant et Peggy Pierre, Merci aussi à l’équipe paramédicale de son soutien, Grâce à vous toutes et tous, à votre compréhension, votre disponibilité et votre patience, j’ai pu me consacrer plus facilement à ce travail de recherche. Il est aussi et avant tout un travail d’équipe. Enfin, un très grand MERCI à ma famille et mes amis… Et MERCI à toi… 4 Résumé De nombreux travaux exposent l’importance et la complexité des liens existant entre le métabolisme et la reproduction. Certaines molécules, en particulier les hormones, agissent à la fois sur l’homéostasie énergétique et sur la régulation de l’axe gonadotrope. Parmi elles, nous pouvons citer la leptine, produite par le tissu adipeux. Ce tissu, longtemps considéré comme un lieu de stockage inerte, est aujourd’hui défini comme un organe endocrinien. Il est la source de nombreuses adipocytokines, dont l’adiponectine. La concentration plasmatique de l’adiponectine est élevée et elle circule dans le sang sous des formes de différents poids moléculaires. Cette adipocytokine se fixe principalement à deux types de récepteurs : l’AdipoR1 exprimé surtout dans le muscle squelettique et l’AdipoR2 plus abondant dans le foie. L’adiponectine augmente la sensibilité des tissus à l’insuline. Dans des modèles pathologiques tels l’obésité, le diabète type 2 et le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK), sa concentration est diminuée (insulino-résistance). L’étude de son rôle dans la reproduction chez la femelle est récente. L’adiponectine pourrait être l’un des liens physiopathologiques entre les anomalies métaboliques (insulino-résistance) et les troubles de fertilité rencontrés chez les sujets obèses, diabétiques et ou les femmes atteintes d’un SOPK. Lorsque ce travail de thèse a débuté, peu de travaux avaient étudié la présence du système adiponectine dans l’ovaire. Nous avons entrepris, tout d’abord, de le caractériser dans l’ovaire de deux espèces animales (poule et rate) et chez la femme. Dans ces trois espèces, il existe une production ovarienne de l’adiponectine et de ses récepteurs. Si l’expression de l’adiponectine apparaît principalement thécale, l’ensemble du système est présent aussi dans l’ovocyte et le corps jaune (rate). Comme le suggèrent certains résultats, l’expression ovarienne de ce système semble varier, selon les espèces, au cours du cycle menstruel chez la femme ou de l’oestrus chez les animaux domestiques. Dans un second temps, nous avons exploré la stéroïdogenèse ovarienne chez ces trois espèces. In vitro, l’adiponectine recombinante humaine augmente la sécrétion de la progestérone (poule) et de l’oestradiol (poule, rate, femme), induite par l’IGF-1. L’adiponectine exerce une action positive sur certaines protéines impliquées dans la stéroïdogenèse, en augmentant leur expression (StAR et P450 aromatase, chez la femme) ou leur activité (suggéré chez la rate). Enfin, certaines voies de signalisation sont activées telles que les MAPKs (ERK1/2 et p38), Akt et l’AMPK. Cette dernière est connue pour être un senseur métabolique important. L’action autocrine et/ou paracrine de l’adiponectine semble s’exercer respectivement sur les cellules de la thèque et de la granulosa. D’après nos 5 résultats et ceux de la littérature, l’adiponectine potentialise les effets de l’IGF-1 et des gonadotrophines (LH). Enfin, elle peut être un marqueur de l’ovulation et peut-être de la qualité ovocytaire. Afin d’essayer d’expliquer les troubles de la fertilité liés à des anomalies métaboliques (diabète ou SOPK), nous avons étudié les effets de fortes concentrations de glucose sur l’expression du système adiponectine et sur la stéroïdogenèse. In vivo, chez des rates devenues diabétiques après un traitement par streptozotocine, l’expression ovarienne des récepteurs AdipoR1 et AdipoR2 n’est pas modifiée. Un résultat identique est obtenu, in vitro, dans des cellules de la granulosa en culture, en présence de concentrations élevées de glucose. En revanche, ces fortes concentrations entraînent une diminution de la sécrétion de progestérone et d’oestradiol induite par la FSH et l’IGF-1, in vitro et in vivo. Afin de mieux préciser le rôle de l’adiponectine dans la physiologie et la pathologie ovarienne, d’autres études sont nécessaires. Des expériences préliminaires ont été déjà menées. Dans une lignée de cellules de la granulosa humaine (KGN), l’invalidation sélective de l’AdipoR1 et de l’AdipoR2 (ARN interférence) suggère que l’AdipoR2 peut être d’avantage impliqué dans la régulation de la stéroïdogenèse alors que l’AdipoR1 semble être lié à la survie cellulaire. Par ailleurs, l’étude de l’influence de l’adiponectine recombinante sur la maturation ovocytaire et le développement embryonnaire est en cours chez la vache, in vitro. Le système adiponectine et la stéroïdogenèse seront explorés dans les cellules de la thèque (modèles animaux). D’après la littérature, l’adiponectine et ses récepteurs s’expriment au niveau central (hypothalamus et l’hypophyse). Nous voulons tester son action potentielle sur le contrôle de la GnRH et des gonadotrophines (modèles cellulaires et animaux). Nous envisageons d’explorer ses liens éventuels avec d’autres adipocytokines notamment la leptine et / ou la résistine. Suite aux résultats obtenus chez la femme, nous souhaitons préciser la relation entre l’adiponectine et la pathologie ovarienne du SOPK et peut-être découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. En conclusion, le système adiponectine s’exprime dans l’ovaire. L’adiponectine paraît réguler la fonction ovarienne de par son action autocrine ou paracrine sur les cellules ovariennes et endocrine sur l’axe hypothalamo-hypophysaire. Les propriétés insulino- sensibilisatrices de l’adiponectine en font un lien potentiel entre la fonction de reproduction et le métabolisme. Ceci contribuerait à expliquer, en partie, les effets délétères du dysfonctionnement métabolique sur la fonction de reproduction. 6 Mots Clé : Adiponectine-Métabolisme-Reproduction-Ovaire-Stéroïdogenèse-Signalisation 7 Résumé en anglais Metabolism and reproduction are two very important and complicated functions. Many hormones act on energy homeostasis and on the regulation of gonadotrope axis. Leptin, one of them, is produced in adipose tissue. At present, this tissue is considered as an endocrine organ. Adiponectin (Adipo), a new adipokine, is abundantly produced by adipocytes. This 25-30 kDa protein circulates in plasma as multimer forms (different molecular weights) at high concentration (5-25 µg/ml), in mammals. Adipo mediates its effects through two known receptors, AdipoR1 and AdipoR2. AdipoR1 and AdipoR2 are mainly expressed in muscle and in liver, respectively. Adipo plays an essential role in the regulation of lipid and carbohydrate metabolism. It can increase insulin sensitivity. Obesity, type 2 diabetes and polycystic ovary syndrome (PCOS) are often associated with insulin resistance and with hypoadiponectinemia. Recently, some evidence suggests that Adipo could regulate reproductive functions. This protein could be a potential link between the metabolic and fertility disorders. This association could exist in diabetic patients and in women with PCOS. Adipo has been described in different tissues but it has been poorly studied in ovary. In this present work, we decided to characterize the Adipo system (Adipo and AdipoR1/AdipoR2) in ovary of two animal species (chicken and rat) and in woman ovary. Herein, we showed the presence of the Adipo and its receptors in the ovary of each species. If Adipo is largely expressed in theca cells, it is almost undetectable in granulosa cells (chicken, rat and woman). In rat, the Adipo system is found in oocyte and corpus luteum. As suggested in some works, Adipo system expression can change during the menstrual cycle, in woman or during oestrus in domestic animal. Then, we explored ovarian steroidogenesis, in these three species. In vitro, we observed that human recombinant Adipo increases IGF- 1-induced progesterone (chicken, rat and woman) and oestradiol (rat and woman) production in granulosa cells. If Adipo increases the expression of steroidogenesis proteins (StAR and P450 aromatase) in woman, it has no effect on their protein amount in rat. Thus, we can speculate that Adipo plays a role in their activity. Furthermore, this adipokine activates different signalling pathways including MAPK (ERK 1/2 and p38) and AMPK. This latter is well known as an important metabolic sensor. Then, Adipo could have an autocrine action on theca cells and a paracrine action on granulosa cells. As shown in our work and in the literature, Adipo improves IGF-1 and gonadotropin effects (LH). Then, Adipo could be an ovulation marker and a marker of oocyte quality. 8 Alterations of glucose concentrations can profoundly affect some reproductive process. Then, we investigate the ovarian steroid production and the proteins level of sterodogenesis key factors in two conditions: in primary rat granulosa cells in the presence of high glucose concentrations and in streptozotocin (STZ)-treated female rats. In these conditions we also determined the protein expression of Adipo receptors, in ovarian cells. High levels of glucose decrease progesterone and oestradiol production in primary rat granulosa cells and in STZ-treated rats. However, the mechanism that leads to reduce ovarian steroid production seems to be different. Moreover, Adipo receptors in ovarian cells are not regulated by glucose. Further experiments will be necessary to determine more precisely the role of Adipo system in ovarian physiology and physiopathology. We have some preliminary results. We will investigate the role of Adipo receptors in granulosa cells. Also, we have determined the effect of inactivation of AdipoR1 and AdipoR2 genes by RNA interference on a human granulosa cell line (KGN). So, in KGN cells, AdipoR2 could modulate steroidogenesis stimulated by FSH or IGF-1. AdipoR1 could act on cellular survival. Moreover, the Adipo system and its role in steroidogenesis will be studied in theca cells, in different species. We are investigating the effect of recombinant Adipo, in vitro, on oocyte maturation and embryonic development in bovine species (result not yet available). Since Adipo and its receptors are present in hypothalamus and pituitary, we will explore, in vitro and in vivo, their role in the secretion of GnRH and gonadotropins. We will also study the relations between Adipo and other adipokines such as leptin and resistin. Then, in human, we will try to explain the relation between Adipo and the PCOS syndrome in order to find new therapeutic targets. In conclusion, adiponectin and its receptors are expressed in ovary. Adiponectin seems to control some ovarian functions through autocrine and paracrine action on ovarian cells and endocrine action on the hypothalamo-pituitary axis. Since adiponectin is an insulin sensitive hormone, it could be a link between metabolism and reproduction functions. This could partly contribute to explain the negative effects of some metabolic disorders on the reproductive functions. Key words: Adiponectin-Metabolism-Reproduction-Ovary-Steroidogenesis-Signalling 9 Publications Avec comité de lecture Chabrolle C, Tosca L, Crochet S, Tesseraud S, Dupont J 2007 Expression of adiponectin and its receptors (AdipoR1 and AdipoR2) in chicken ovary: Potential role in ovarian steroidogenesis. Domest Anim Endocrinol. Nov 33(4): 480-7 Tosca L, Chabrolle C, Uzbekova S, Dupont J 2007 Effects of Metformin on Bovine Granulosa Cells Steroidogenesis: Possible Involvement of Adenosine 5' Monophosphate- Activated Protein Kinase (AMPK). Biol Reprod Mar 76(3):368-78. Chabrolle C, Tosca L, Dupont J 2007 Regulation of adiponectin and its receptors in rat ovary by human chorionic gonadotrophin treatment and potential involvement of adiponectin in granulosa cell steroidogenesis. Reproduction Apr; 133 (4):719-31. Tosca L, Uzbekova S, Chabrolle C, Dupont J 2007 Possible role of AMPK in the metformin-mediated arrest of bovine oocytes at the GV stage during in vitro maturation. Biol Reprod Sep; 77 (3):452-65. Dupont J, Chabrolle C, Ramé C, Tosca L, Coyral-castel S 2008 Role of the PPARs, AMPK and adiponectin in the ovary. PPAR Res. 2008; 2008:176275 Tosca L, Chabrolle C, Crochet S, Tesseraud S, Dupont J 2008 IGF-1 receptor signaling pathways and effects of AMPK activation on IGF-1-induced progesterone secretion in hen granulosa cells. Domest Anim Endocrinol Feb; 34(2): 204-16 Coyral-Castel S, Tosca L, Ferreira G, Jeanpierre E, Ramé C, Lomet D, Caraty A, Monget P, Chabrolle C, Dupont J 2008 The effect of AMPK activation on GnRH secretion in GT1-7 cells and its potential role in hypothalamic regulation of the œstrus cyclicity in rats. J neuroendocrinol. Mar ; 20(3) : 335-46. Tosca L, Chabrolle C, Dupont J 2008 AMPK : APMK: Métabolisme et Fertilité Femelle. Med Sci (Paris). Mar ; 24(3) : 297-300. Chabrolle C, Jeanpierre E, Tosca L, Ramé C, Dupont J. 2008 Effects of high level of glucose on the steroidogenesis and the expression of adiponectin receptors in rat ovarian cells. Reprod Biol Endocrinol. Mar; 19: 6-11. Chabrolle C, Tosca L, Ramé C, Lecomte P, Royere D, Dupont J. 2008 Adiponectin increases IGF-1-induced progesterone and oestradiol secretion in human granulosa cells. Fertil Steril (in Press) Dupont J, Froment P, Ramé C, Pierre, P, Coyral-Castel S, Chabrolle C 2008 Rôle des acides gras sur les fonctions ovariennes: Implications des Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) et des adipocytokines. Gynécologie Obstétrique et Fertilité (in press). 10