Université Paris-Sud XI Faculté de Médecine École Doctorale « Cancérologie - Biologie - Médecine – Santé » (CBMS) Spécialité : Immunologie Thèse pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Paris-Sud XI The role of human Natural Killer cells (NK) in anti-tumour immune responses Présentée et soutenue publiquement par Giulia FREGNI Le 28 Octobre 2011 Jury Pr Antoine DURRBACH Président Dr Vincent VIEILLARD Rapporteur Dr Francesco COLUCCI Rapporteur Pr Marie-Françoise AVRIL Examinateur Dr Philippe BOUSSO Examinateur Dr Anne CAIGNARD Directeur de thèse Acknowledgments I thank Pr Antoine Durrbach for having accepted to preside my dissertation committee. I am very grateful to Dr Francesco Colucci and Dr Vincent Vieillard for having agreed to referee my thesis and for the precious comments on how to improve this manuscript. I am thankful to Dr Philippe Bousso for having accepted to be examiner of my thesis. My sincere gratitude to Pr Marie-Françoise Avril for the last four years of collaboration and for having accepted to examine my thesis. Without your participation this work could never have been accomplished. My deep and sincere thanks to my thesis supervisor Dr Anne Caignard. Anne, merci beaucoup de m’avoir accueillie à l’IGR pour mon premier stage « Leonardo da Vinci », de m’avoir donné la possibilité de préparer ma thèse sous votre direction, de m’avoir aidée à développer mon indépendance, pour votre esprit toujours positif, pour votre encouragement, pour la confiance que vous m’avez témoignée… Anne, merci pour tout! My research was supported by a three year-fellowship from “Cancéropôle Ile de France”. One supplemental year of fellowship has been funded by “Ligue Nationale contre le Cancer”, allowing me to achieve my thesis. Un remerciement spécial va à la co-directrice de l’équipe Armelle Blondel et à tous les autres membres, pour avoir partagé avec moi ces quatre dernières années ou seulement une partie de celles-ci: Renée pour toutes les réponses aux questions techniques que je vous ai posé, Laetitia et Sarra pour les moments éclatants que vous m’avez fait passer, Marylène pour votre disponibilité et gentillesse, Nadège pour ton apport scientifique et pour tout le reste, Maxime et Jonathan pour les mois pendant les quels nous avons partagé le bureau, Raouf pour le prélèvements « difficiles » que tu as récupéré, Farida pour ma première expérience d’encadrement, Emma et Meriem pour prendre le relai du projet Immumela... Aurélie, je ne t’ai pas oubliée... tu m’as manqué cette année au labo!!! Un grand merci à toi parce que depuis le début tu m’as beaucoup aidée… je me rappelle encore la soirée que tu as passé avec moi à l’IGR pour améliorer ma demande de financement. Merci pour les longues et nombreuses journées de manips passées ensemble en L2, pour tes explications sur la bureaucratie française, pour ton support dans les moments difficiles, mais surtout pour ton amitié…Merci beaucoup! A huge thanks to patients, for having accepted to be included in this study. My sincere gratitude to all the medical and nursing staff of Bichat, Cochin, Curie and Foch Hospitals for their participation in this project: Dr E. Maubec, Dr E. Marinho, Dr L. Deschamps, Dr S. Albert, Dr C. Guedon, C. Deschamps, I. Scheer, Dr S. Jacobelli, Dr F. Boitier, Dr N. Franck, Dr I. Gorin, Dr N. Wallet-Faber, Pr N. Dupin, Pr B. Couturaud, Dr V. Fourchotte, Dr X. Sastre, Dr D. Mitilian. A sincere thanks to all the collaborators with whom I have had the pleasure to work: Dr I. Cremer, Pr L. Zitvogel, Dr N. Delahaye, Dr S. Rusakiewicz, Pr N. Gervois, Dr E. Donnadieu, Dr H.-J. Garchon, Dr C. Capron, Dr A. Maresca, Dr C. Fauriat, Dr S. Caillat-Zucmann, Dr N. Rouas-Freiss. Gianfranco, un pensiero speciale per te. Grazie per avermi introdotto alle NK e per avermi incoraggiata a rimanere a Parigi. Un grand merci à tous les membres présents et passés des équipes « Hosmalin » et « Lucas » et de la plateforme d’« Immuno-biologie », que j’ai eu le plaisir de connaitre et qui ont rendu agréable mon travail au 8ème étage du bâtiment G. Roussy. Charly, un remerciement particulier à toi. Merci de m’avoir initiée à la cytométrie 8 couleurs mais surtout de m’avoir dédié ton temps même pendant des moments très difficiles pour toi. Grazie ad Annalisa, per la tua allegria, per le serate trascorse insieme e per il pomeriggio in bateau. Merci à Véronique et Magali, per avermi presentato Alessia, per le chiacchierate in italiano e i consigli sul post-doc. Alessia, é stato un piacere conoscerti! Un grosso in bocca al lupo per il proseguimento del tuo dottorato! Merci aux autres doctorants et jeunes chercheurs que j’ai connu à Cochin: Pablo, Rania, Jérôme, Nathalie, Ana, Hélène, Quitterie, François, Florent… Raluca, merci pour ton amitié et pour les nombreux diners après le labo. Shufang, thank you for letting me training my english! Maria, un remerciement particulier à toi. Merci pour ton amitié, pour tous les bons et les mauvais moments que nous avons partagé à Cochin et au dehors…de m’avoir conseillé Milos pour les vacances, trop bien ! J’espère que nos expériences de post-doc ne nous éloigneront pas trop ! Thanks to all the people who let me enjoy my stay in Paris! Grazie alle persone con cui ho condiviso il « Leonardo », perché hanno contribuito a rendere unica la mia iniziale esperienza parigina. All’Eugi, che nonostante le nostre comuni origini, il destino mi ha fatto incontrare qui a Parigi. Grazie per i tre anni che abbiamo condiviso e per l’amicizia che ne è nata. Grazie ai “logici” che ho conosciuto, per le cene e le serate in compagnia: Giulio, Alberto, Laura, Giulio, Beniamino. Un pensiero speciale va alle persone a me più care che ogni volta che rientro in Italia continuano a farmi sentire come se non fossi mai partita: Giuli, Matte, Lara, Luca, Chiari, Ele, Ia, Laura, Sara, Giaco, Marco, Jules, Biagio, Leo, Dani e alle espatriate come me: Iri e Gio. Eli, grazie per la nostra amicizia, per come si è trasformata e rinnovata. Grazie per la dolce notizia che mi hai dato via mail perché non potevi aspettare… un grosso in bocca al lupo per la nuova vita che sta(i) per iniziare! Eugi, con te ho condiviso i primissimi anni di laboratorio e tante altre esperienze che hanno fatto nascere e maturare la nostra amicizia. Grazie per i soggiorni qui a Parigi, per i weekend a sciare con Diego, e per aver sognato insieme l’organizzazione delle vacanze...chissà che l’estate prossima non si riesca a partire davvero? Grazie perché il sapore del nostro legame, delle nostre risate e lunghe chiacchierate non é mai cambiato. Grazie alla mia numerosa famiglia, per la calorosa accoglienza che mi riservate ogni volta che torno. Un ringraziamento particolare va alle mie cugine Chiara e Raffaella e a Vania (ormai cugina acquisita), per i weekend in cui siete venute a trovarmi… e alla nonna Evolle, per gli ottimi pranzi domenicali che mi prepari ogni volta che torno. Ai miei genitori e a mio fratello Matte. Grazie per avere sempre creduto in me e per essermi stati vicini nonostante la lontananza. Non ci sono parole per esprimervi la mia gratitudine. Dulcis in fundo… a Mattia. Per tutto l’amore, l’appoggio e la pazienza che mi hai dimostrato in questi anni, a te dedico questa tesi. Abstract Natural Killer cells are cytotoxic lymphocytes involved in the immune response against tumours and infections. We investigated the NK-mediated functions in response to clear-cell renal cell carcinoma (RCC) and metastatic melanoma, two human immunogenic tumours. We showed that certain VHL mutations increased RCC cell susceptibility to NK lysis. VHL loss of function correlated with lower expression levels of membrane HLA-I molecules on VHL-mutated RCC and a decreased triggering of inhibitory NK receptors compared to RCC with a functional VHL. In stage IV melanoma patients, we showed that blood NK cells displayed a unique NKp46dim/NKG2Adim phenotype and high lytic potential towards melanoma cells. Following chemotherapy, NK cell function was reduced and the phenotype modulated. To study melanoma- infiltrating NK cells, we have set up experimental conditions to characterise NK cells in metastatic LNs from stage III melanoma patients. Our preliminary data show that, compared to normal LNs, NK cells from metastatic LNs are altered. Our findings suggest that oncogenic-dependent immunogenicity, tumour-associated NK alterations and chemotherapy are important factors that must be taken into account in the choice of immunotherapeutic protocols based on NK cells. Key words: NK cells, RCC, metastatic melanoma, tumour immunogenicity, immunotherapy Résumé Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs cytotoxiques impliqués dans la réponse immune contre les infections et les tumeurs. Pendant ma thèse j’ai étudié la fonctionnalité des cellules NK humaines en réponse à des lignées cellulaires de carcinome rénal à cellules claires (RCC) et de mélanome métastatique, deux tumeurs immunogènes. Nos résultats montrent que certaines mutations de VHL augmentent la susceptibilité des lignées RCC à la lyse NK. La perte de fonction de VHL corrèle avec une expression membranaire diminuée des molécules HLA-I par les lignées RCC mutées pour VHL. Chez les patients atteints de mélanome métastatique de stade IV, nous avons décrit un phénotype particulier des NK sanguines (NKp46dim/NKG2Adim) qui leur confère une forte activité antitumorale. Après traitement des patients par chimiothérapie, la fonctionnalité NK était réduite et le phénotype modifié. Pour étudier les cellules NK infiltrant les mélanomes, nous avons mis au point des conditions expérimentales pour caractériser les cellules NK de ganglions métastatiques de patients de stade III. Nos résultats préliminaires montrent que, par rapport aux ganglions sains, les NK des ganglions métastatiques présentent un phénotype altéré et un potentiel fonctionnel diminué. Nos résultats suggèrent que d’une part l’immunogénicité dépendante des oncogènes et d’autre part les altérations NK induites par la tumeur et/ou par la chimiothérapie sont des facteurs importants à considérer dans le choix des protocoles d’immunothérapie basés sur les cellules NK. Mots clés : cellules NK, mélanome métastatique, carcinomes rénaux, immunogénicité des tumeurs, immunothérapie Abbreviations 5-FU: 5-fluorouracil ADC: adoptive cell therapy ADCC: antibody-dependent-cell-cytotoxicity AICL: activation-induced C-type lectin AJCC: American Joint Committee on Cancer ALL: acute lymphoblastic leukaemia AML: acute myeloid leukaemia AN: absolute numbers APC: antigen presenting cell BAT3: HLA–B-associated transcript 3 BiMAb: bispecific monoclonal antibody BM: bone marrow CD: cluster of differentiation CLA: cutaneous lymphocyte-associated antigen CLP: common lymphoid progenitors CML: chronic myelogenous leukemia CRC: colorectal carcinoma CSC: cancer stem cell CTC: circulating tumour cells CTL: cytotoxic T lymphocytes CTLA4: cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen 4 DNAM-1: DNAX accessory molecule-1 dNK: NK cells in maternal deciduas DTIC: dacarbazine EBV: Epstein-Barr Virus EGFR: epidermal growth factor receptor ELP: early lymphoid precursors FCS: foetal calf serum FcRI: Fc receptor I  FDA: Food and Drug Administration FGFR1: fibroblast growth factor receptor 1 Flt3L: fms-like tyrosine kinase-3 ligand GIST: gastrointestinal stromal tumours GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GVHD: graft versus host disease GvL: graft-versus-leukaemia HA: hemagglutinin antigens HCMV: human cytomegalovirus HIF: hypoxia inducible factor HLA: human leukocyte antigen HPC: hematopoietic precursor cells HSC: hematopoietic stem cells HSCT: hematopoietic stem cell transplantation HSPG: heparan sulphate proteoglycans ICs: immunocytokines ICAM-1: intracellular adhesion molecule-1 IFN-b: interferon alpha-b IFN:interferon- Ig: immunoglobulin ILT: immunoglobulin-like transcripts iNK: immature NK-cells ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activating motif ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif KIRs: Killer Immunoglobulin-like receptors KLRB1: Killer cell lectin-like receptor subfamily B member 1 LAMP-1: lysosomal-associated-membrane protein-1 LDH: lactate-dehydrogenase LFA-1: lymphocyte function associated-antigen 1 LIF: leukaemia inhibitory factor LIRs: leukocyte Ig-like receptors LMP2: latent membrane protein 2 of Epstein-Barr virus LN: lymph node LRC: leukocyte receptor complex mAb: monoclonal antibody MCA: methylcholanthrene MCMV: murine cytomegalovirus mDC: myeloid DC MFI: mean flouorescence intensity MHC: major histocompatibility complex MICA: MHC-class I-related chain A MIP-1:macrophage inflammatory protein-1 MIRs: macrophage Ig-like receptors MLTA: malignant lung tissue area mRCC: metastatic RCC N-CAM: neural cell adhesion molecule NCR: natural cytotoxicity receptors NHL: non-Hodgkin’s lymphoma NK: Natural Killer NKP: NK cell precursors NSCLC: non small cell lung cancer o/n: overnight PB: peripheral blood PBMC: peripheral blood mononuclear cells PC5: PE-Cy5 PC-PLC: phosphatidylcholine-specific phospholipase C pDC: plasmacytoid DC PDGF: platelet-derived growth factor PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate pro-NK: NK cell progenitors Pt: patient PVR: poliovirus receptor Rag: recombination-activating gene RCC: renal cell carcinoma rhuIL2: recombinant human interleukin 2 RITA: Reactivation of p53 and Induction of Tumour cell Apoptosis RT: room temperature SCF: stem cell factor sHLA: soluble HLA siRNA: small interfering RNA SLT: secondary lymphoid tissue STAT1: signal transducer and activator of transcription factor-1 STRA13: stimulated by retinoic acid-13 SRRs: SLAM-related receptors TCR: T-cell receptor TGFtransforming growth factor  TIL: tumour infiltrating lymphocytes TNFtumour necrosis factor- TNM: tumour node metastasis TNM: tumour node metastasis TRAIL: TNF-related apoptosis-inducing ligand Treg: regulatory T cells UCB: umbilical cord blood UC-MSC: umbilical cord mesenchymal stem cells UISS: University of California Integrated Staging System ULBP: UL16-binding proteins VEGF: vascular endothelial growth factor VHL: von Hippel Lindau Contents Acknowledgments Abstract Résumé Abbreviations List of figures and tables PREAMBLE ........................................................................................................ 1 INTRODUCTION ............................................................................................... 3 1. NATURAL KILLER CELLS (NK) ................................................................. 4 1.1. Introduction ......................................................................................................... 4 1.2. NK cell function ................................................................................................... 6 1.2.1. Effector function ..................................................................................................... 6 1.2.1.1. Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) .................................................. 7 1.2.1.2. Natural Cytotoxicity ................................................................................................. 7 1.2.2. Cytokine secretion .................................................................................................. 9 1.2.3. Proliferation .......................................................................................................... 10 1.3. NK cell receptors and ligands .......................................................................... 12 1.3.1. ADCC receptor: CD16 .......................................................................................... 12 1.3.2. Natural cytotoxicity receptors (NCR) ................................................................... 12 1.3.2.1. NKp46 (NCR1) ...................................................................................................... 13 1.3.2.2. NKp44 (NCR2) ...................................................................................................... 13 1.3.2.3. NKp30 (NCR3) ...................................................................................................... 14 1.3.3. C-type lectin-like NKG2 receptor superfamily ..................................................... 15 1.3.3.1. CD94/NKG2 heterodimers ..................................................................................... 15 1.3.3.2. NKG2D .................................................................................................................. 17 1.3.4. Co-receptors involved in NK cell cytotoxicity ..................................................... 19 1.3.4.1. DNAM-1 (CD226) ................................................................................................. 19 1.3.4.2. NKp80 .................................................................................................................... 20 1.3.4.3. 2B4 (CD244) and NTB-A ...................................................................................... 20 1.3.5. Killer Immunoglobulin-like receptor family ......................................................... 21 1.3.6. Immunoglobulin-like transcripts (ILT) receptor family ....................................... 25 1.4. Natural Killer cell development and maturation ........................................... 25 1.4.1. Stages of maturation ............................................................................................. 27 1.4.2. NK cell precursors ................................................................................................ 30 1.5. Natural Killer cell “education” ........................................................................ 32 1.6. Natural Killer cell compartments .................................................................... 35 1.7. Regulatory NK cells: interactions with DC and T cells ................................. 39 1.8. NK cell memory ................................................................................................. 41 2. NATURAL KILLER CELLS AND CANCER ............................................. 44 2.1. In vitro and in vivo evidences of NK-mediated cancer killing ....................... 44 2.2. Natural Killer cells in cancer patients ............................................................. 46 2.2.1. Phenotype of circulating NK cells ........................................................................ 46 2.2.2. Tumour Infiltration and NK-associated phenotype............................................... 47 2.3. NK-mediated cancer immunotherapy ............................................................. 49 3. TWO IMMUNOGENIC TUMOURS ............................................................ 54 3.1. Renal cell carcinoma (RCC) ............................................................................ 54 3.1.1. Clear-cell RCC and VHL ...................................................................................... 55 3.1.2. Treatments of metastatic RCC .............................................................................. 56 3.2. Melanoma .......................................................................................................... 57 3.2.1. Staging and survival .............................................................................................. 58 3.2.2. Melanoma Immunogenicity .................................................................................. 59 3.2.3. Melanoma Treatments .......................................................................................... 60 RESULTS ........................................................................................................... 63 1. Article 1 ....................................................................................................................... 64 Mutations of the von Hippel-Lindau gene confer increased susceptibility to natural killer cells of clear-cell renal cell carcinoma. 2. Article 2 ....................................................................................................................... 80 Unique functional status of natural killer cells in metastatic stage IV melanoma patients and its modulation by chemotherapy. 3. Additional results........................................................................................................ 97 Analysis of NK cells from metastatic lymph nodes of stage III melanoma patients. Purpose ........................................................................................................................... 98 Material and methods ..................................................................................................... 98 Results .......................................................................................................................... 103 Discussion .................................................................................................................... 109 GENERAL DISCUSSION and PERSPECTIVES ....................................... 112 APPENDICES ................................................................................................. 121 Appendix 1 ............................................................................................................................ 122 Serum Soluble HLA-E in Melanoma: A New Potential Immune-Related Marker in Cancer. Appendix 2 ............................................................................................................................ 133 Early evaluation of natural killer activity in post-transplant acute myeloid leukemia patients. REFERENCES ................................................................................................ 145