ETH Library The interplay of IgE and its high affinity receptor FcεRI Doctoral Thesis Author(s): Pochanke, Veronika Publication date: 2005 Permanent link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-005062847 Rights / license: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information, please consult the Terms of use. Diss. ETHNo. 16149 The Interplay of IgE and its High Affinity Receptor FceRI A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGYZURICH forthe degree of Doctor ofNatural Sciences presented by VERONIKA POCHANKE Dipl. Biol., Université de Lausanne born 07.09.1975 citizen ofWil (SG), Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Hans Hengartner, examiner Prof. Dr. RolfM. Zinkernagel, co-examiner Dr. Kathy D. McCoy, co-examiner 2005 Tableof Contents 1 Table of Contents Summary 3 Zusammenfassung 5 Abbreviations 7 1 Introduction 11 1.1 Immunoglobulin E (IgE) 11 1.2 The high affinity IgE receptor, FcsRI 19 1.3 Allergy 24 1.4 Central Question 30 2 Results Part 1 31 Induction ofIgE and allergic-type responses in fur mite-infested mice 31 2.1 Abstract 31 2.2 Introduction 32 2.3 Materials and Methods 34 2.4 Results 36 2.5 Discussion 46 3 Results Part II 51 Generation and characterization ofhmFcsRIocß Tg mice 51 3.1 Abstract 51 3.2 Introduction 52 3.3 Materials and Methods 54 3.4 Results 60 3.5 Discussion 76 4 Results Part III 79 Generation ofa muFcsRIa-huIgGiFc fusion protein 79 4.1 Abstract 79 4.2 Introduction 80 4.3 Materials and Methods 82 4.4 Results 86 2 Table of Contents 4.5 Discussion 97 5 Discussion 101 5.1 The functions ofIgE 101 5.2 The epidemic ofallergy 102 5.3 Mechanisms ofIgE-mediated immune responses 103 5.4 Remaining questions to be answered 103 5.5 Questions addressed in this thesis 106 5.6 Concluding remarks 108 6 References 109 Acknowledgements 127 Curriculum Vitae 129 Summary 3 Summary Allergic diseases, such as eczema, rhinitis, asthma, and food allergies, have greatly increased in the past two decades, mainly in developed countries. Immunoglobulin E (IgE) is known to play a crucial role in the development of allergies, however, the physiological function of IgE has most likely evolved to provide host defense mechanisms against parasite infections. IgE-mediated immune responses involve similar mechanisms during both allergic reactions and parasite clearance. Exposure to antigens leads to crosslinking of antigen-specific IgE molecules bound to high affinity IgE receptors, FcsRI, expressed predominantly on mast cells and basophils. Activation of FcsRI mediates the release of allergic mediators, which are responsible for symptoms of allergy. Understanding the mechanisms regulating IgE-dependent responses is therefore essential to provide effective therapy against allergic disease and to alleviate damage caused by parasite infections. The goal ofthe present thesis was to investigate the initial requirements for IgE production and to elucidate the role ofFcsRI expression on different cell subsets. Animal models that closely resemble the pathology of human allergic conditions and allow measurement of physiologic parameters are required to efficiently address these questions. We therefore established and characterized a novel allergy model based on infestation of mice with fur mites. The advantage of this model lies in the usage of natural murine ectoparasites allowing physiological exposure to antigens, which strongly resembles the human atopic sensitization. Fur mites were found to induce high levels ofserum IgE in a T cell- and In¬ dependent manner. Moreover, our results strongly suggest that mite antigen entry occurs via the skin ofinfested mice leading to T cell activation and B cell isotype switch to IgE in skin-draining lymph nodes. Furthermore, mite-induced mast cell degranulation in the skin was detected implying that some of the IgE produced in response to mite infestation was antigen-specific. In the second part of this thesis we investigated the functions of FcsRI. An intriguing difference in the structure and cellular distribution of the human and murine high affinity IgE receptor was previously found. While murine FcsRI has an obligatory tetrameric structure and is only expressed on mast cells and basophils, the human receptor can be additionally expressed as a trimer found on eosinophils, dendritic cells, Langerhans' cells, monocytes, macrophages, and platelets. To investigate the role of FcsRI expression on 4 Summary these effector and antigen presenting cells, we generated a murine transgenic system (hmFcsRIaß Tg mice) that mirrors the human distribution pattern of FcsRI. Although mRNA expression of the high affinity IgE receptor was successfully demonstrated in the targeted cells of the hmFcsRIaß Tg mice, FcsRI protein expression could not be found. Further investigation of the model is therefore required to determine the reason for the absence ofdetectable FcsRI protein expression and to evaluate how it may be overcome. Lastly, to provide an additional tool for the investigation ofFcsRI we made an attempt to generate a specific antibody against the a chain ofthe murine receptor. Such an antibody is crucial for specific and efficient analysis ofthe expression ofthe murine FcsRI, which was important for the study of FcsRI transgenic mice. To achieve the production of an anti- muFcsRIa antibody, a fusion protein composed ofthe extracellular domain ofthe murine FcsRIa and the human IgGi Fc portion was generated and used to immunize FcsRIa- deficient mice. However, as the first series ofimmunizations did not result in the synthesis of anti-muFcsRIa antibodies and because a commercial anti-mouse FcsRIa antibody became available during the completion of this project, the investigation was interrupted. Nevertheless, the successfully generated and purified muFcsRIa-huIgGiFc fusion protein is available in large amounts and can be used in future ifrequired. In conclusion, the regulation of IgE production and the effector functions induced by IgE interactions with FcsRI expressed on different cell types are still not fully understood. Analysis of novel animal models, such as those presented in this thesis, may provide answers to some of the still open questions and eventually lead to successful therapy of allergy and parasite-induced disease. Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Allergische Reaktionen, wie z.B. Ekzem, Heuschnupfen, Asthma und Nahrungsmittelallergien, sind in den letzten 20 Jahren vor allem in entwickelten Ländern drastisch gestiegen. Die Entstehung von Allergien ist zum grossen Teil vom Immunoglobulin E (IgE) abhängig, die physiologische Funktion von IgE dientjedoch zum Schutz gegen parasitäre Infektionen. Die Immunantwort, die durch IgE ausgelöst wird, umfasst ähnliche Mechanismen bei allergischen Reaktionen wie auch bei der Abwehr gegen Parasiten. Kontakt mit Antigenen führt zu einer Kreuzvernetzung von antigenspezifisehen IgE Molekülen, die an Hochaffinitätsrezeptoren für IgE, FcsRI, gebunden sind. FcsRI ist vorwiegend aufMastzellen und Basophilen exprimiert und seine Aktivierung führt zur Freisetzung von pro-inflammatorischen Substanzen, z.B. Histamin, welche die klassischen Merkmale von Allergie hervorrufen. Mechanismen der von IgE ausgelösten Immunantworten zu verstehen, ist daher essentiell um wirksame Mittel gegen Allergien und parasitäre Krankheiten zu finden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Voraussetzungen für die IgE Produktion zu untersuchen, und die Rolle von FcsRI Expression auf diversen Zelltypen aufzuklären. Tiermodelle, welche die Pathologie von menschlichen allergischen Erkrankungen nachahmen und die es ermöglichen, physiologische Parameter zu messen, sind erforderlich um diese Fragen effizient anzugehen. Wir haben ein neues Allergiemodel etabliert und charakterisiert, das aufdem Befall von Mäusen durch Fellmilben basiert. Der Vorteil dieses Models liegt darin, dass natürliche Mausektoparasiten den Kontakt mit Antigenen in physiologischer Art und Weise ermöglichen, was wiederum der atopischen Sensibilisierung bei Menschen ähnlich ist. Wir haben gezeigt, dass Milbenantigene durch die Haut von befallenen Mäusen aufgenommen und über die Lymphe in die dränierenden Lymphknoten transportiert werden. Dort führt das Antigen zur Aktivierung von T Zellen, die zur Produktion von IL-4 stimuliert werden. Diese Th2 Antwort führt zum IgE-Klassenwechsel in B Zellen und schliesslich zu stark erhöhten IgE Serumwerten. Zudem haben wir milbenabhängige Mastzelldegranulation in der Haut beobachtet, was daraufhindeutet, dass ein Teil an IgE, das als Antwort aufden Milbenbefall produziert wurde, Antigen-spezifisch sein muss. 6 Zusammenfassung Im zweiten Teil dieser Arbeit haben wir die Funktionen des FcsRI Rezeptors untersucht. Ein überraschender Unterschied in der Struktur und in der zellulären Verteilung zwischen dem IgE Rezeptor von Mensch und Maus wurde bereits vor einigen Jahren erkannt. Während FcsRI in der Maus eine ausschliesslich tetramerische Struktur aufweist und nur aufMastzellen und Basophilen exprimiert wird, kann FcsRI im Menschen eine trimerische Form annehmen, die auch auf eosinophilen Granulozyten, dendritischen Zellen, Langerhans-Zellen, Monozyten, Makrophagen und Thrombozyten exprimiert werden kann. Um die Funktion von FcsRI Expression auf diesen Zellen zu untersuchen, haben wir ein transgenes System (hmFcsRIaß Tg Maus) hergestellt, das die menschliche FcsRI Expression widerspiegelt. Obwohl die mRNA Expression des IgE Rezeptors in den Zellen der hmFcsRIaß transgenen Mäuse erfolgreich gezeigt wurde, konnten wir keine FcsRI Protein Expression nachweisen. Das Modell erfordert deshalb weiterer Analyse, um den Grund für die fehlende FcsRI Protein Expression zu identifizieren, und zu beurteilen wie diese zu überwinden sei. Darüber hinaus haben wir versucht, einen spezifischen Antikörper gegen die a Kette des FcsRI der Maus herzustellen. Ein solcher Antikörper ist erforderlich für eine spezifische und effiziente Untersuchung der FcsRI Expression, was für die Studie der FcsRI transgenen Mäuse ausschlaggebend war. Um die Produktion von anti-muFcsRIa Antikörpern zu erzielen, haben wir ein Fusionsprotein hergestellt, das aus der extrazellulären Domäne der a Kette von FcsRI und dem Fc-Teil des menschlichen IgGi Antikörpers bestand. Dieses Fusionsprotein wurde anschliessend zur Immunisierung von FcsRIa"" Mäusen verwendet. Da aber die ersten Immunisierungsserien nicht zur Synthese des erwünschten Antikörpers geführt hatten, und weil ein kommerzieller anti-muFcsRIa Antikörper während der Durchführung dieses Projektes erhältlich wurde, haben wir die Versuche eingestellt. Dennoch steht das erfolgreich generierte und isolierte Fusionsprotein für allfällige weitere Studien zur Verfügung. Schlussfolgernd ist festzuhalten, dass die Regulation der IgE Produktion und die Folgen der Interaktionen zwischen IgE und FcsRI noch nicht gänzlich geklärt sind. Analyse neuer Tiermodelle, wie z.B. solcher die in dieser Dissertation präsentiert wurden, könnten Antworten aufeinige der offenen Fragen liefern und schliesslich zur erfolgreichen Therapie gegen Allergie und parasitäre Infektionen führen. Abbreviations 7 Abbreviations Ab Antibody AD Atopic dermatitis Ag Antigen AID Activation-induced cytidine deaminase Amp Ampicillin APC Antigen presenting cell BAL Bronchoalveolar lavage BMMC Bone marrow-derived mast cell bp Base pair BSA Bovine serum albumin BSS Balanced salt solution CD Cluster ofdifferentiation CD40L CD40 ligand cDNA Complementary DNA CDR Complementarity-determining region Cs IgE heavy chain constant region CFA Complete Freund's adjuvant CSR Class-switch recombination DC Dendritic cell DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Eos Eosinophil ER Endoplasmic reticulum Fab Antigen-binding fragment FACS Fluorescence activated cell sorting Fe Crystallizable fragment FCS Fetal calfserum FcsRI High affinity IgE receptor FcsRIa Alpha chain ofthe high affinity IgE receptor