Universidad Nacional de Rosario Facultad de Ciencias Médicas “Interacciones entre glucocorticoides y células T reguladoras durante la infección chagásica. Estudios celulares y moleculares” Doctorando: Lic. Rodrigo Fernández Bussy Directora: Dra. Ana Rosa Pérez Año: 2016 Tesis para optar al título de Doctor en Ciencias Biomédicas ÍNDICE ÍNDICE ÍNDICE .................................................................................................................................................... I ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ................................................................................................... IV PALABRAS PROVENIENTES DEL INGLÉS .................................................................................. VII RESUMEN .......................................................................................................................................... VIII CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 1.1 CÉLULAS T REGULADORAS ................................................................................................... 1 1.1.1 Generalidades sobre células T reguladoras ........................................................................... 1 1.1.2 Identificación de las células Tregs .......................................................................................... 2 1.1.3 Clasificación de las células Tregs ............................................................................................ 4 1.1.4 Blanco de acción y especificidad de las células Tregs ............................................................ 8 1.1.5 Activación y mecanismos de acción supresora ...................................................................... 9 1.1.6 Células Tregs y procesos tumorales ..................................................................................... 12 1.1.7 Células Tregs y autoinmunidad ........................................................................................... 13 1.1.8 Papel de las Tregs en las infecciones ................................................................................... 14 1.1.9 Potencial terapéutico de las Tregs ....................................................................................... 15 1.1.10 Células Tregs e infecciones parasitarias ............................................................................. 16 1.2 ENFERMEDAD DE CHAGAS .................................................................................................. 19 1.2.1 Definición y breve historia. .................................................................................................. 19 1.2.2 Epidemiología ....................................................................................................................... 20 1.2.3 Agente etiológico: Trypanosoma cruzi ................................................................................. 22 1.2.4 Ciclo de vida del parásito e infección vectorial .................................................................... 23 1.2.5 Diversidad genética del parásito .......................................................................................... 25 1.2.6 Vías de transmisión .............................................................................................................. 26 1.2.7 Fases y manifestaciones clínicas de la Enfermedad de Chagas ........................................... 28 1.2.8 Patogénesis .......................................................................................................................... 30 1.2.9 Tratamiento de la Enfermedad de Chagas ........................................................................... 31 I ÍNDICE 1.2.10 Papel de las células Tregs en la Enfermedad de Chagas .................................................... 31 1.3 GLUCOCORTICOIDES ............................................................................................................. 33 1.3.1 Liberación de Glucocorticoides ............................................................................................ 33 1.3.2 Mecanismos de acción a nivel molecular ............................................................................. 36 1.3.3 Efectos de los Glucocorticoides sobre el sistema inmune ................................................... 39 1.3.4 Glucocorticoides y Tregs ...................................................................................................... 40 1.4 INFECCION EXPERIMENTAL CON Trypanosoma cruzi EN DISTINTAS CEPAS MURINAS: ANTECEDENTES DEL GRUPO DE TRABAJO ....................................................... 42 CAPÍTULO 2: HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................ 46 CAPÍTULO 3: MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................................... 48 3.1 Animales e infección experimental ............................................................................................. 48 3.2 Monitoreo de la infección aguda ................................................................................................. 48 3.3 Anestesia, analgesia y eutanasia .................................................................................................. 49 3.4Obtención y disgregación de los órganos linfoides ...................................................................... 49 3.5 Análisis citofluorométrico de las poblaciones celulares ............................................................. 50 3.5.1 Anticuerpos Monoclonales .................................................................................................. 50 3.5.2 Inmunomarcación celular..................................................................................................... 50 3.5.3 Análisis citofluorométrico .................................................................................................... 51 3.6 Tratamiento in vivo con anticuerpos monoclonales anti-CD25 .................................................. 52 3.7 Aislamiento y transferencia adoptiva de células T CD4+CD25+ ................................................. 53 3.7.1 Obtención de una suspensión celular enriquecida en células T CD4+CD25+ ........................ 53 3.7.1.1 Selección negativa de las células CD4+ .......................................................................... 53 3.7.1.2 Selección positiva de las células CD25+ ......................................................................... 54 3.7.2 Transferencia adoptiva de Tregs .......................................................................................... 55 3.8 Determinación de los niveles plasmáticos de corticosterona ...................................................... 55 3.9 Tratamiento con IL-2 .................................................................................................................. 56 3.10Adrenalectomía .......................................................................................................................... 56 3.11Tratamientos realizados con IL-2, Dexametasona y la combinación de ambos ......................... 57 3.12 Administración de LPS ............................................................................................................. 57 II ÍNDICE 3.13Análisis Estadístico .................................................................................................................... 57 CAPÍTULO 4: RESULTADOS ............................................................................................................ 59 4.1 Caracterización del curso de la infección experimental en ratones BALB/c y C57BL/6 ........... 59 4.2 Dinámica de la población Treg en sangre periférica y órganos linfoides ................................... 65 4.2.1Timo....................................................................................................................................... 65 4.2.1.1 Frecuencia y número de las Tregs en timo ................................................................... 65 4.2.1.2 Fenotipo de las Tregs en timo ....................................................................................... 68 4.2.2 Sangre y órganos linfoides secundarios ............................................................................... 70 4.2.2.1 Frecuencia y número de las Tregs en periferia ............................................................. 70 4.2.2.2 Fenotipo de las Tregs y Tef en periferia ........................................................................ 75 4.3Inmunointervenciones orientadas a modificar los niveles de Tregs ............................................. 81 4.3.1Tratamiento con PC61 ........................................................................................................... 81 4.3.2Transferencia adoptiva de células Tregs ............................................................................... 84 4.3.3Administración de IL-2 durante el curso de la infección. ...................................................... 87 4.3.4 Administración de IL-2, dexametasona o ambos de manera previa a la infección. ............. 89 4.4 Evaluación del papel de los GCs endógenos sobre la población de células Tregs ..................... 95 CAPÍTULO 5: DISCUSIÓN ................................................................................................................. 98 CAPÍTULO 6: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .................................................................... 109 CAPÍTULO 7: REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA ............................................................................ 110 III ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS AcMo: (Acrónimo) Anticuerpos monoclonales ACTH: (Acrónimo) Hormona Adrenocorticotropina Aex: Adenosina extracelular AMP: (Acrónimo) Monofosfato de adenosina AMPc: (Acrónimo) AMP cíclico APC: (Acrónimo) Aloficocianina APCs: (Acrónimo) Células presentadoras de antígenos ATP: (Acrónimo) Trifosfato de adenosina CDs: Células dendríticas CRH: (Acrónimo) Hormona Liberadora de Corticotropina CT: Corticosterona CTLA-4: (Acrónimo) Antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico dpt: Días post-tratamiento Dex: Dexametasona DN: Doble Negativa DP: Doble Positiva DTU: (Acrónimo) Unidades Discretas de Tipificación ECG: Electrocardiograma ELISA: (Acrónimo) Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas FITC: (Acrónimo) Isotiocianato de fluoresceína FoxP3: (Acrónimo) Forkhead box P3 GCs: Glucocorticoides GFP: (Acrónimo) Proteína fluorescente verde GITR: (Acrónimo) Gen relacionado con la familia de receptores de TNF-α inducido por glucocorticoides GLsc: ganglios linfáticos subcutáneos GR: (Acrónimo) Receptor de glucocorticoides IV ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS GRE: (Acrónimo) Elementos de Respuesta a Glucocorticoides GVHD: (Acrónimo) Enfermedad de injerto versus huésped HAI: Hemoaglutinación indirecta HPA: Hipotálamo-Pituitario-Adrenal i.p.: Intraperitoneal IBD: (Acrónimo) Enfermedad inflamatoria intestinal IDO: Indolamina 2,3-dioxigenasa IFI: Inmunofluorescencia indirecta IFN-γ: Interferón γ IL-10: Interleucina10 IL-12: Interleucina 12 IL-15: Interleucina 15 IL-2: Interleucina 2 IL-35: Interleucina 35 IL-5: Interleucina 5 IL-6: Interleucina 6 IL-7: Interleucina 7 IPEX: (Acrónimo) Síndrome de inmunodeficiencia, poliendocrinopatía y enteropatía ligado al cromosoma X LAG-3: (Acrónimo) Gen de activación linfocitaria 3 LPS: Lipopolisacárido mARN: (Acrónimo) ARN mensajero MBP: (Acrónimo) Proteína básica de mielina MCC: Miocardiopatía Chagásica Crónica MEPRA: Misión de Estudios de Patología Regional Argentina MHC: (Acrónimo) Complejo mayor de histocompatibilidad NK: (Acrónimo) Células asesinas naturales NO: (Acrónimo) Óxido Nítrico Nrp1: (Acrónimo) Neuropilina-1 V ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS p.i.: Post-infección PBS: Buffer Fosfato Salino PCR: (Acrónimo) Reacción en cadena de la polimerasa PE: (Acrónimo) Ficoeritrina PerCP: (Acrónimo) Peridin-clorofila pTregs: (Acrónimo) Células T reguladoras periféricas SF: Solución Fisiológica SFB: Suero Fetal Bovino SP: Simple Positiva T. cruzi: Trypanosoma cruzi T : Células T convencionales conv TCR: (Acrónimo) Receptor de células T T : Células T efectoras ef TGF-β: (Acrónimo) Factor de crecimiento transformante β TLRs: (Acrónimo) Receptores tipo Toll, Toll Like Receptors TNF-α: (Acrónimo) Factor de necrosis tumoral α Tregs: Células T reguladoras tTregs: (Acrónimo) Células T reguladoras tímicas VI PALABRAS PROVENIENTES DEL INGLÉS PALABRAS PROVENIENTES DEL INGLÉS Background: Ruido de fondo Buffer: Solución reguladora Bystander: Activación/Inhibición inespecífica Discrete Typing Units: Unidades Discretas de Tipificación Dot Plot: Gráfico de puntos Forward Scatter: Dispersión Frontal Gate: Área Gatting: Selección de poblaciones GCs Receptor: Receptor GCs Graft versus Host Disease: Enfermedad de injerto versus huésped Homing: Tráfico Loop: Circuito Naïve: Inmadura o sin experiencia antigénica Non-obese diabetic: Diabéticos no obesos Output: Salida Pool: Compartimiento común Potter: Homogeneizador Pellet: Sedimento celular Screening: Cribado o proceso de detección Scurfy: Escamoso o con caspa Sham: Simulador / Cirugía simulada Side Scatter: Dispersión Lateral Splicing: Empalme T Cell Receptor: Receptor de Células T Tethering: Atado o unido Toll Like Receptor: Receptor tipo Toll Wild type: Cepa salvaje VII RESUMEN RESUMEN El desenlace de la infección por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es el resultado de una compleja serie de interacciones donde los mismos mecanismos que se ponen en marcha para contener al parásito son también capaces de inducir daño tisular. En función de ello es evidente que el desarrollo de la respuesta anti-infecciosa estará acompañado de una respuesta reguladora inmuno-endócrina orientada a reducir las consecuencias patológicas de esta tripanosomiasis. En este proceso de auto-control podrían tener un papel particular las células T reguladoras (Tregs) y los glucocorticoides (GCs). Los linfocitos Tregs CD4+FoxP3+ constituyen una población inmunosupresora que puede actuar sobre poblaciones efectoras por contacto directo o mediante la secreción de citocinas inmunoreguladoras. Por otra parte, las citocinas pro-inflamatorias producidas durante un proceso inflamatorio o infeccioso, activan el eje hipotálamo pituitario adrenal (HPA) con la consiguiente liberación de GCs, los que ejercen efectos inmunosupresores sobre la respuesta inmune. A su vez Los GCs podrían favorecer el desarrollo de las Tregs durante procesos inflamatorios, sin embargo esta posibilidad no se ha investigado en profundidad en procesos infecciosos. En nuestro laboratorio se han caracterizado dos modelos de infección experimental murina con T. cruzi que muestran una diferente resolución de la enfermedad aguda. Mientras que los animales C57BL/6 presentan un 100% de mortalidad como consecuencia de una respuesta inflamatoria exacerbada, la cepa BALB/c es parcialmente resistente a la infección y exhibe una respuesta defensiva más balanceada. El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel que las Tregs podrían desempeñar en el patrón de susceptibilidad/resistencia previamente observado y en las alteraciones inmunológicas que tienen lugar a nivel tímico durante la infección con T. cruzi. Los estudios también apuntaron a analizar la relación que se establece entre las células Tregs y los GCs, como así también a la manipulación de la población Treg como potencial estrategia inmuno-moduladora en la infección chagásica. VIII RESUMEN Los resultados obtenidos indican que el perfil de resistencia observado en los animales BALB/c se asocia a mayores niveles basales de Tregs en la periferia y a una expansión más eficiente de esta población, lo cual se refleja en un mejor balance homestático entre células Treg y células T efectoras (T ). Por el contrario, en los animales C57BL/6, la mayor susceptibilidad se asocia a un ef cierto grado de parálisis de la población de células Tregs, lo cual sugiere que los mecanismos supresores serían largamente superados por la respuesta efectora. Además, y en relación a esto último, mostramos que los GCs endógenos serían necesarios para mantener el balance Tef/Treg durante el curso de la infección. Por último, revelamos que la administración de Dex+IL-2 puede modular positivamente el balance T /Treg e influenciar de forma diferencial el curso de la infección. Estudios futuros que ef recurran a esta estrategia permitirían optimizar terapias que expandan específicamente a las Tregs en otros contextos inflamatorios. IX