UNIVERSIDAD DE LEÓN ADAPTACIÓN A LA SIEMBRA INVERNAL Y TOLERANCIA AL FRÍO EN LENTEJA (Lens culinaris Medik). MAPEO DE QTLs INVOLUCRADOS TESIS DOCTORAL ABEL BARRIOS CASADO INGENIERO AGRÓNOMO León 2012 AGRADECIMIENTOS ¡Ya era hora! es lo que estoy pensando mientras escribo estas líneas. Después de no sé cuántos años y unas cuantas arrugas más en la cara, parece que se acerca el día en el que este trabajo ha finalizado, aunque en estos momentos no me lo creo. Como animales gregarios que somos los humanos, no he de olvidarme de la gente que ha estado a mi lado durante la elaboración de este trabajo, qué menos agradecérselo y darles las gracias: En primer lugar quiero agradecer al Instituto Tecnológico Agrario de la Junta de Castilla y León, por la concesión de la beca predoctoral, y a su personal por todo lo que me han ayudado. Al Dr. Marcelino Pérez de la Vega, por su tutoría, dirección y consejos. Te has portado como un padre para mí. Al Dr. Constantino Caminero, gracias por absolutamente todo, todo y todo, por la tutoría y dirección, por tus consejos, por la educación, por tus risas… y sobre todo gracias por la confianza depositada en mí ¡te debo mucho! A Trinidad Aparicio, esa chica que cuando la conocí chupaba piruletas y vestía de colores vivos vivos (y sigue vistiendo igual). No he visto una persona que trabaje tan bien y tan eficientemente como tú, ya sea en invernadero, laboratorio o campo, ya hiele o haga 40ºC. Ha sido un honor trabajar contigo. Gracias por muchísimas cosas, y en especial, por tu eterna sonrisa. Al Dr. Manuel Rodríguez, el experto lentejero del ITACyL que me ha ayudado tanto. Nunca se me olvidará el día que me explicaste el concepto de interacción. Gracias por ser como eres, me lo he pasado bomba contigo, eres de lo más desestresante. A los investigadores del ITACyL, Paco, Nieves, Aurora, Pierre, Tivi, Avelino, Álvaro, Charo, Laura, Rosa, Teresa, Mari Carmen (x2), Marta y David, Miguel Ángel, Javier, José Antonio… y alguno más que se me olvida, me habéis asesorado muy bien. En especial, quiero agradecer al Dr. José Luis Montoya, tu forma de trabajar es impresionante, y es más, pagaría por trabajar otra vez contigo, aquello no fueron horas de trabajo, fueron horas de clases magistrales! A la gente de León, Pedro, Cristina, Patricia, Raúl, Cecilia… cada vez que iba a veros volvía lleno de saberes. Al grupo de leguminosas y demás familita, Alberto, Alicia, Alexis, Menchu, Ángel, Javier (x2), Laura (x3 ó x4), Miguel Ángel (x2), Eduardo, Loic, María, Carmelo, André, Yoli, Almudena, María Ángeles (la de los papeles), Verónica (y sus compas de informática)… sois muchos… Os doy las gracias y os pido perdón por todo lo que habéis tenido que aguantarme, que sé que no es poco. Anda que no echamos horas en el labo ¿verdad Ali y Alberto? A las chicas del labo, Sonia, Lorena, Begoña, Marta, Noemí, Katherina … por hacer más llevadero el trabajo gracias a vuestra ayuda. Quiero incluir a la mujer de los microsatélites, la Dra. Ana María Casas, me resolviste muchas dudas, desde Zaragoza. A los Drs. Fred J. Muehlbauer y Kevin McPhee, por las lentejas cedidas y por toda la ayuda que enviasteis desde el otro lado del Charco. Al equipo de GenXPro, Peter Winter, Günter Kahl, Ralf, Alejandro, Anne, Björn, Ruth, Eduardo, Nico, Cornelia, Kido… por acogerme tan bien en Frankfurt. A Nicolás Armenteros (IGP Lenteja de la Armuña) y al Dr. Javier Ponga (IGP Lenteja Pardina de Tierra de Campos), gracias por estar al otro lado del teléfono, o del e-mail, para darme todo cuanto os pedí, me ha sido de mucha ayuda. A Álvaro Novella, experto lentejero que no cuidaba, sino que mimaba los ensayos de Peñaflor de Hornija, y además nos asesoraba como lo que es, el mejor. A los tractoristas y operarios del ITACyL, Carmelo, Tomás, Eusebio, Luis, Felina, Santiago, Arturo, Encarna, Elena,…son mogollón… lo a gusto que os quedasteis el día que acabamos con los ensayos de lenteja y os entiendo ¡qué placer! aunque ahora los eche de menos. En especial, quiero agradecer a Olegario Esteban, persona honrada y ejemplar como nadie, que mimó los ensayos de Zamadueñas, y que más ha valorado mi trabajo desde el principio, y por ello te lo agradezco mucho. Esta tesis también es parte tuya. Al Dr. Baudilio Herrero, mi profe de Botánica. Gracias por tus consejos y por “engancharme” al mundo de las plantas, cuando no era más que un chico no muy convencido de estudiar “Horto”. Para ir finalizando, a mis padres y hermanos, que aunque no tengáis ni idea de lo que estoy haciendo, sois también responsables de este trabajo, porque os debo todo. Y lo más importante de mi vida, mi Bego. Carros y carretas has tenido que aguantarme, mi pañuelo de lágrimas, sé que has sufrido tanto como yo con esta tesis y eso no tiene precio. No se hubiera podido realizar si no es gracias a ti. RESUMEN El bajo nivel de autoabastecimiento de la lenteja que presenta España, importando el 78% de sus necesidades, unido a los indudables beneficios agronómicos de este cultivo dentro de un marco de agricultura sostenible y respetuosa con el medio ambiente, reduciendo, por ejemplo, las necesidades en la rotación de los cada vez más caros fertilizantes nitrogenados, hacen de este tradicional cultivo una alternativa interesante en las rotaciones de secano de la meseta Castellano-Leonesa. No obstante, la desatención que ha sufrido durante décadas, en Castilla y León se manifiesta en bajos e inestables rendimientos, obteniendo unas producciones medias que no llegan a la cuarta parte de lo que produce la cebada, niveles productivos lejos del umbral de rendimiento que debería tener para ser interesante. Esta situación ha conducido al abandono del cultivo, quedando relegado a zonas protegidas bajo el amparo de figuras de calidad y con una fuerte dependencia de la concesión de subvenciones. En consecuencia, resulta interesante indagar, y así lo ha planteado la presente tesis en sus objetivos, si la lenteja podría finalmente ser un cultivo lo suficientemente rentable como para ser incluido en las rotaciones de cultivo del secano castellano-leonés mediante dos estrategias combinadas: La primera, mediante el adelanto de la tradicional fecha de siembra primaveral a otra más temprana, invernal, y la segunda, mediante la realización de trabajos de selección de líneas adaptadas a siembras invernales, de las que carece el mercado actualmente. En función de ello, aquí también se plantea una contribución a la definición del ideotipo a tener en cuanta dentro de un plan de mejora genética de lenteja adaptada a la siembra invernal en las condiciones de los secanos de Castilla y León, considerando la identificación de las variables climáticas que más pueden influir en la adaptación a la fecha de siembra. Se han evaluado dos poblaciones de lenteja RIL F , Precoz x WA8649041y 6:7 BGE016365 x ILL1918, en cuanto a rendimiento y estabilidad realizando siembras primaverales e invernales durante tres campañas de cultivo (2005/06, 2006/07 y 2007/08) en dos localidades con distintos potenciales productivos, empleando como testigos 11 variedades comerciales. Además con una de las poblaciones, se han evaluado caracteres relacionados con la supervivencia en campo a los rigores invernales, con la fenología del cultivo, con la morfología general y con los componentes del rendimiento, evaluándose también la tolerancia a las heladas en cámara de ambiente controlado. Paralelamente se ha construido un mapa genético para la población Precoz x WA8649041 que ha permitido la detección de QTLs vinculados a los caracteres evaluados. La analítica estadística considerada ha utilizado métodos no paramétricos para el estudio del la estabilidad varietal, diversas descomposiciones del modelo de análisis de varianza, el análisis AMMI, modelos de regresión factorial que incluyen covariables genotípicas y ambientales, y técnicas híbridas entre las anteriores. Para la construcción del mapa genético los grupos de ligamiento fueron establecidos mediante el cálculo del valor LOD del test por independencia y el orden de los marcadores se estableció mediante el método de mapeo por regresión, y se calcularon las distancias mediante la función de Kosambi. En la detección de QTLs se ha aplicado el método “Interval Mapping”, “Multiple-QTL Model” y el test de Kruskal-Wallis. El LOD umbral se calculó de manera independiente para cada carácter con el test de permutaciones (1.000 permutaciones). El estudio del rendimiento y su estabilidad en las variedades comerciales más representativas ha reflejado las grandes diferencias que hay entre las mismas, con variedades cuya utilización queda descartada por los bajos rendimientos así como un comportamiento muy inestable, mientras que otras sí han mostrado niveles aceptables de producción y estabilidad. Si bien todas comparten una característica común, están orientadas para la siembra primaveral, porque en siembras invernales, ninguna de ellas ha mostrado niveles aceptables de producción y estabilidad. En la zona en estudio, tradicionalmente la lenteja se ha sembrado, y se siembra, en primavera en condiciones de secano, si bien no parece la fecha de siembra más adecuada, para las condiciones climatológicas de la meseta Castellano-Leonesa, cara al aprovechamiento de los recursos hídricos y a la disminución del estrés generado por la sequía terminal. En función de los resultados obtenidos, el adelanto de la fecha de siembra se ha mostrado como una estrategia eficaz para el aumento del rendimiento, con aumentos medios de rendimiento del 58,33% respecto de las mismas líneas sembradas en primavera. Asimismo, la realización de siembras tempranas con las líneas seleccionadas por su rendimiento y estabilidad refleja unos aumentos medios del rendimiento del 98,73% en comparación con los mejores testigos sembrados en primavera, quedando así justificados los trabajos de selección de líneas orientadas a siembras invernales. La rentabilidad del cultivo de la lenteja considerando esta mejora resulta competitiva frente a la obtenida por la cebada, cultivo mayoritario en los secanos castellanos y leoneses. Se ha detectado una importante influencia en el modelo de análisis de varianza del rendimiento de la interacción genotipo x ambiente, explicada principalmente por los comportamientos diferenciales motivados por el cambio en la fecha de siembra y, especialmente, por los detectados entre ambientes de siembra invernal. El ambiente y los genotipos han contribuido por igual a la variación detectada, y, dentro de la componente ambiental, ha sido la fecha de siembra la que más ha explicado la variabilidad detectada. El análisis AMMI ha detectado dos posibles ejes de explicación de la interacción genotipo x ambiente, que han permitido un apoyo para la identificación de covariables ambientales y genotípicas involucradas en dicha interacción genotipo por ambiente. Así, las covariables ambientales que más han influido en la interacción genotipo por ambiente han sido el número de días de heladas por debajo de -6ºC durante el desarrollo vegetativo y las temperaturas mínimas de mínimas durante la maduración. Así, la adaptación a la fecha de siembra está influida principalmente por los fríos intensos durante el desarrollo vegetativo y por las temperaturas más frescas durante el llenado y maduración de la semilla. El ideotipo asociado positivamente al rendimiento general ha resultado aquel caracterizado por la alta producción de biomasa pero con baja producción comparativa de paja (lo que se traduce en índice de cosecha alto y alta productividad por planta). En cuanto a la fenología, el ideotipo ha de ser precoz en cuanto a floración y con duración larga en los periodos de llenado de grano y maduración. De esta forma se facilita un largo periodo reproductivo, pero con un buen escape a los estreses producidos por la sequía y los calores típicos del final del ciclo de cultivo. Referente a morfología, las plantas deben ser altas, pero con poca longitud a la primera vaina, lo que se traduce en un mayor número de pisos florales, y en último término, que produzcan un mayor número de vainas. Asimismo, también parece interesante el contemplar genotipos con tamaño de foliolo pequeño y, con un menor nivel de significación, con expresión de menos flores por pedúnculo y parámetros de tolerancia a las heladas altos. En lo referente a la adaptación al adelanto de la fecha de siembra, la tolerancia a las heladas ha sido la covariable genotípica que mayor peso específico ha mostrado en la explicación de la interacción genotipo x ambiente, principalmente en lo referente a la adaptación de los genotipos dicho cambio en la fecha de siembra. Así, el ideotipo buscado para realización de fecha de siembra invernal, en especial en aquellas zonas caracterizadas por el rigor alto de las heladas, debe presentar parámetros altos de tolerancia a las heladas, que parecen no ser tan necesarios, e incluso podrían tener cierta influencia negativa, en siembras primaverales. Asimismo, se verán más beneficiados, en cuanto al diferencial de expresión de rendimiento motivado por la siembra invernal aquellos genotipos con mayor longitud de planta, capaces de generar valores altos de biomasa y con periodo largo en la duración de la floración. Dentro de las interacciones particulares entre variables climáticas con covariables genotípìcas, la que mayor influencia ha presentado en la explicación de los comportamientos diferenciales del rendimiento ha sido la habida entre la tolerancia genotípica a las heladas y el número de días de helada por debajo de -3ºC durante el desarrollo vegetativo., cuantificándose en 21,6 kg/ha por cada día de helada la diferencia en rendimiento para el incremento en un nivel de tolerancia genotípica dentro de los definidos en el material de estudio. A partir de la población Precoz x WA8649041 se ha construido un mapa genético formado por 13 grupos de ligamiento, con un tamaño de 577,5 cM y contiene 232 loci, de los cuales 153 son AFLPs, 44 son MFLPs, 11 son ISSRs, 23 son SSRs y uno morfológico, el color del cotiledón (Yc). Se han detectado un total de 60 QTLs, ocho de rendimiento per se, ocho de supervivencias en campo, 22 de tolerancia a heladas en cámara de ambiente controlado, siete de covariables fenológicas, nueve de covariables morfológicas y seis de covariables relacionadas con el rendimiento. La distribución en los grupo de ligamiento ha sido: en el 1, 10 QTLs, en el grupo de ligamiento 3, 12 QTLs, en el grupo de ligamiento 4, dos QTLs, en el grupo de ligamiento 6, cuatro QTLs, en el grupo de ligamiento 11, un solo QTL, y en el grupo de ligamiento 12, 22 QTLs. En este último caso casi todos ellos localizados en un intervalo de 3 cM, constituyendo la región del mapa que más actividad ha mostrado.