UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI URBINO “Carlo Bo” DIPARTIMENTO DI SCIENZE PURE E APPLICATE Corso di Dottorato di Ricerca in SCIENZE DI BASE E APPLICAZIONI Curriculum SCIENZE CHIMICHE E SCIENZE FARMACEUTICHE XXX CICLO NUOVI FLUOROFORI E CHEMOSENSORI PER ANIONI E CATIONI METALLICI E CARRIER PER ANIONI; SINTESI E STUDI DI SENSING E DI TRASPORTO Settore Scientifico Disciplinare: CHIM/03 RELATORE DOTTORANDA Chiar.mo Prof. Vieri Fusi Dott.ssa Angela Ricci Anno Accademico 2016/2017 Capitolo 1. INTRODUZIONE LA CHIMICA SUPRAMOLECOLARE 3 1.1 CHIMICA SUPRAMOLECOLARE IN BIOLOGIA 5 1.2 LEGANTI MACROCICLICI DI SINTESI 7 1.2.1 ETERI CORONA 10 1.2.2 CRIPTANDI 11 1.2.3 CICLOFANI 12 1.2.4 CALIXARENI 12 1.3 POLIAZACICLOALCANI 13 1.4 RICONOSCIMENTO MOLECOLARE 16 1.4.1 FATTORI CHE INFLUENZANO LA FORMAZIONE E LA STABILITÀ DEI COMPLESSI 17 1.4.2 TERMODINAMICA 19 1.4.3 INTERAZIONI SUPRAMOLECOLARI 21 1.5 CHEMOSENSORI 23 1.5.1 CHEMOSENSORI DI FLUORESCENZA 25 1.5.2 MODULAZIONE DELLA FLUORESCENZA 26 1.6 COORDINAZIONE CATIONICA E ANIONICA 33 1.7 CENNI SUL TRASPORTO CELLULARE 36 1.7.1 TRASPORTATORI IONICI DI ORIGINE NATURALE 38 1.7.2 TRASPORTATORI IONICI DI SINTESI 40 1.8 METODI DI VALUTAZIONE DEL TRASPORTO ANIONICO 43 Capitolo 2. OBIETTIVI SCOPO DELLA RICERCA 47 2.1 UNITÀ LEGANTE 51 2.2 UNITÀ FOTOATTIVA 52 2.2.1 CHEMOSENSORI BASATI SU UNITÀ OSSADIAZOLICHE 52 2.2.2 CHEMOSENSORI BASATI SULL’UNITÀ HNBO 55 2.3 TRASPORTATORI PER ANIONE CLORURO 56 Capitolo 3. RISULTATI E DISCUSSIONE 3.1 SINTESI E STUDIO DI L1 59 3.1.1 SINTESI DEL LEGANTE L1 59 3.1.2 STUDIO DELLE PROPRIETÀ IN SOLUZIONE DI L1 61 3.1.2.1 Comportamento acido-base 61 3.1.2.2 Assorbimento UV-Vis in funzione del pH 62 3.1.3 STUDIO DELLE PROPRIETÀ COORDINATIVE DI L1 64 3.1.3.1 Studio delle strutture cristalline dei complessi mononucleari [ZnL1]2+ [CuL1]2+ 64 3.1.3.2 Coordinazione del catione Zn2+ 66 3.1.3.3 Studio spettrofotometrico di L1 in presenza del catione Zn2+ 69 3.1.3.4 Studio del complesso [ZnL1]2+ come metallo-recettore per anioni 74 3.1.3.5 Analisi NMR del complesso [ZnL1]2+ e del complesso in presenza di Cl- 78 3.1.4 CONCLUSIONI 81 1 3.2 SVILUPPO DI LEGANTI BASATI SULL’UNITÀ FOTOATTIVA PyPyD 83 3.3 SINTESI E STUDIO DI L2 83 3.3.1 SINTESI DEL FLUOROFORO PyPyD 83 3.3.2 SINTESI DI L2 85 3.3.3 STUDIO SPETTROFOTOMETRICO DI L2 86 3.3.4 CONCLUSIONI 86 3.4 SINTESI E STUDIO DI L3 88 3.3.1 SINTESI DI L3 88 3.3.2 STUDIO SPETTROFOTOMETRICO DI L3 89 3.3.3 CONCLUSIONI 90 3.5 SVILUPPO DI LEGANTI BASATI SUL FLUOROFORO HNBO 92 3.6 SINTESI E STUDIO DI L4 92 3.6.1 SINTESI DI L4 92 3.6.2 STUDI SPETTROFOTOMETRICI DI L4 IN FUNZIONE DEL pH 94 3.6.3 STUDIO DELLE PROPRIETÀ COORDINATIVE DI L4 98 3.6.3 CONCLUSIONI 104 3.7 STUDIO DI L5 105 3.7.1 SINTESI DI L5 105 3.7.2 STUDIO DELLE PROPRIETÀ COORDINATIVE DI L5 105 3.7.3 CONCLUSIONI 108 3.8 SVILUPPO DI TRASPORTATORI PER IONE CLORURO 109 3.8.1 SINTESI DEI TRASPORTATORI T1, T2, T3 E T4 109 3.8.2 STUDI DI TRASPORTO: METODO GENERALE DEL SAGGIO HPTS NMDG-Cl 113 3.8.2.1 Risultati e Discussione del Saggio di Trasporto HPTS NMDG-Cl 114 3.8.3 CONCLUSIONI 121 Capitolo 4. PARTE SPERIMENTALE 4.1 SPETTROSCOPIE 122 4.2 POTENZIOMETRIA 124 4.2.1 METODO DI CALCOLO 126 4.3 HILL PLOT: SAGGIO HPTS NMGD-Cl 128 4.4 METODI GENERALI DI SINTESI 130 4.5 SINTESI DEL LEGANTE L1 131 4.6 FORMAZIONE DEI COMPLESSI DI L1 133 4.7 SINTESI DEL LEGANTE L2 136 4.8 SINTESI DEL LEGANTE L3 140 4.9 SINTESI DEL LEGANTE L4 141 4.10 SINTESI DEL LEGANTE L5 145 4.11 SINTESI DEI TRASPORTATORI T1, T2, T3 E T4 146 Ringraziamenti 153 Riferimenti Bibliografici 154 2 Capitolo 1. INTRODUZIONE LA CHIMICA SUPRAMOLECOLARE La chimica è la scienza che studia la composizione della materia e le sue trasformazioni, all’interno di essa si estende la chimica supramolecolare, quella branca della chimica che si occupa di entità organizzate di elevata complessità, in cui due o più specie chimiche sono tenute assieme da forze intermolecolari non covalenti e selettive.1 In natura, la chimica supramolecolare è alla base dei principali sistemi biologici che regolano numerose funzioni vitali e altamente specifiche, come fenomeni di riconoscimento, trasmissione di segnali, trasporto, reazioni enzimatiche o recettoriali per citarne alcune. Questa scienza nasce pertanto traendo ispirazione dai sistemi complessi di origine naturali, in cui una specie di dimensioni maggiori detta recettore, oppure host, coordina selettivamente e reversibilmente un specifico substrato di dimensioni inferiori, detto guest, per dare origine a un addotto dotato di un elevato grado di organizzazione strutturale e dotato di funzioni e proprietà ben determinate (Figura 1). Figura 1 Rappresentazione schematica della chimica molecolare e della chimica supramolecolare. 3 Le basi della chimica supramolecolare sono state poste alla fine del XIX secolo, quando il chimico tedesco Hermann Emil Fisher formula il principio di “chiave-serratura”, tutt’oggi utilizzato per descrivere l’assemblaggio di aggregati molecolari, come ad esempio il complesso enzima-substrato.2 L’identificazione e lo studio dettagliato delle interazioni di non legame, tra cui il legame a idrogeno, hanno permesso di comprendere la struttura delle proteine e dei più importanti aggregati biologici come il DNA. Ciò ha condotto alla progettazione e la sintesi di strutture basate su queste interazioni, in particolare agli inizi degli anni ’60 sono stati sviluppati i primi leganti macrociclici per cationi metallici, quali ciflofani, sferandi e carcerandi per citarne alcuni. La chimica supramolecolare fu definita dal chimico francese Jean-Marie Lehn, come la «chimica degli aggregati molecolari di più alta complessità risultanti dall'associazione di due o più specie chimiche legate assieme da forze intermolecolari» e ancora come “chimica oltre la molecola”.3 Nel 1987, Jean-Marie Lehn vinse il premio Nobel per la chimica grazie alla scoperta di una nuova classe di molecole, dette criptofani, in grado di coordinare selettivamente i cationi. Lo scorso dicembre 2016, la chimica supramolecolare è stata nuovamente la protagonista del premio Nobel assegnato ad uno dei più grandi scienziati dell’ultimo ventennio, Fraser Stoddart. Il chimico britannico ha ideato e progettato le prime macchine molecolari, o nanomacchine, cioè sistemi molecolari interconnessi che grazie all’utilizzo della chimica dinamica covalente producono movimenti simil-meccanici e svolgono un lavoro utile in grado di spostare processi meccanici o chimici.4 I principali progetti avanzati sono stati i rotaxani e l’anello di Borromeo molecolare, riportati in Figura 2. Brevemente, il rotaxano è una molecola costituita da un anello macrociclico attraversato da parte a parte da un frammento lineare in cui l’unico modo per rompere la molecola è spezzare un legame covalente; mentre gli anelli di Borromeo molecolari consistono in tre macrocicli meccanicamente interconnessi tra loro, legati in modo che la rottura di un anello permette la dissociazione degli altri cicli. Attualmente, la ricerca scientifica è in forte espansione e la chimica supramolecolare è alla base delle più innovative nanotecnologie. 4 a) b) Figura 2 a) Rotaxano; b) anelli di Borromeo molecolari. Come accennato, la chimica supramolecolare è una scienza multidisciplinare che coinvolge numerosi settori, che includono sia la chimica organica che la chimica inorganica, ma anche la cristallografia, la nanochimica per arrivare fino alla biologia e alla medicina moderna. Basti pensare a quanti sono i processi biochimici basati sull’aggregazione di più subunità molecolari, nei quali i complessi formati possono svolgere nuove e specifiche funzioni e presentare caratteristiche completamente differenti rispetto alle singole unità che li compongono. Il riconoscimento e il trasporto molecolare sono sicuramente due dei principali settori in cui gli addotti supramolecolari giocano un ruolo chiave e verso il quale abbiamo focalizzato la nostra attenzione per lo sviluppo di nuovi leganti, approfonditi in dettaglio successivamente. 1.1 CHIMICA SUPRAMOLECOLARE IN BIOLOGIA In natura i sistemi supramolecolari sono essenziali per la sopravvivenza di ogni organismo, sono alla base dei complessi processi biologici, della struttura e della funzionalità di moltissimi enzimi, del riconoscimento antigene-anticorpo, della trasmissione neuronale, della trascrizione e traduzione del DNA e del trasporto attivo attraverso le membrane lipofile. Tra gli innumerevoli esempi che si possono citare a riguardo, uno sicuramente degno di nota è il gruppo eme, riportato in Figura 3, un 5 classico modello di complesso metallico costituito da uno scheletro porfirinico che coordina selettivamente uno ione ferro o magnesio. La porfirina è un macrociclo formato da quattro anelli pirrolici uniti da ponti metilenici, la chelazione dello ione avviene per mezzo dei quattro atomi di azoto eterociclici che costituiscono la cavità al centro del legante. L’eme è il gruppo prostetico essenziale per la funzione di diverse proteine, tra cui l’emoglobina in cui lo ione coordinato è il catione di Fe(II), l’ossigeno molecolare viene legato reversibilmente dal ferro, indispensabile dunque per il trasporto nel sangue. Figura 3 Il gruppo eme (Fe-porfirina). La clorofilla, invece, è un pigmento presente nelle cellule vegetali ed è composta dal gruppo eme coordinante uno ione Mg(II), è responsabile del passaggio di elettroni attraverso reazioni di ossidoriduzione che stanno alla base della fotosintesi clorofilliana. In natura esistono anche complessi molecolari che possono indurre delle vere e proprie trasformazioni del substrato, si parla quindi di catalisi a livello supramolecolare. Il sistema recettoriale è in grado di legare selettivamente il substrato mediante siti di interazioni non covalenti, ma possiede anche gruppi funzionali appropriati per reagire con esso e rilasciare poi i prodotti, rigenerando il “reagente” per un nuovo ciclo. La reattività e la catalisi a livello supramolecolare coinvolgono due passaggi fondamentali: formazione del legame e trasformazione del substrato in prodotti. Un esempio può essere quello dell’idrolisi dell’ATP che avviene per mezzo di poliammine protonate policicliche. In particolare, l’ATPasi (Na+/K+ ATPasi) lega fortemente l’ATP e la scinde in ADP e fosfato inorganico, 6 come mostrato in Figura 4. La reazione di defosforilazione avviene grazie di una molecola di acqua coordinata dall’enzima per mezzo da uno ione Mg(II), la presenza del metallo complessato è perciò di fondamentale importanza e funge da catalizzatore per la reazione. Inoltre, l’ATPasi è una proteina di transmembrana che coordina e trasporta selettivamente i cationi sodio e potassio da una parte all’altra della membrana lipidica, l’energia necessaria per il trasporto viene fornita dall’idrolisi di una molecola di ATP. Figura 4 Defosforilazione di una molecola di ATP da parte dell’enzima Na+/K+ ATPasi. 1.2 LEGANTI MACROCICLICI DI SINTESI La straordinaria importanza dei composti supramolecolari in campo biologico, ha fortemente alimentato la ricerca di nuovi leganti di sintesi in grado di coordinare molecole target. Nel corso degli anni infatti, traendo ispirazione dai complessi di origine naturale, sono stati sviluppati e studiati moltissimi recettori di sintesi, che hanno riscosso interesse sia in campo medico che in molti altri ambiti. Molti recettori hanno una struttura macrociclica composta da gruppi coordinativamente attivi disposti all’interno di una struttura ciclica abbastanza ampia da poter ospitare il substrato, in grado di interagire e/o legare attraverso legami a idrogeno, interazioni dipolo-dipolo, ione-dipolo, ione-ione o π-π stacking una molecola guest. In questo modi i composti supramolecolari che si formano sono più stabili e il legante risulta essere più selettivo. Tra i vari processi di sintesi per la produzione di complessi supramolecolari, un passaggio chiave è quello della formazione dei legami covalenti tra i 7 diversi precursori che dovranno interagire secondo uno schema ben definito e organizzato per ottenere il legante o il macrociclo, nel caso sia ciclico, desiderato. Esistono tre modelli principali da seguire che saranno di seguito brevemente descritti. Template effect. Consiste nella sintesi del legante mediante l’ausilio di uno ione metallico, che può legarsi temporaneamente o permanentemente al legante formato. Il meccanismo viene anche definito assemblaggio metallo-assistito, in cui lo ione ha il compito di imporre ai reagenti la corretta conformazione per ottenere la molecola finale desiderata.5 I primi leganti ad essere stati sintetizzati mediante questo metodo furono gli eteri corona. In particolare la sintesi prevede l’utilizzo dello ione potassio come templante. In linea generale, il template effect è un processo cinetico 6 e solitamente il metallo impiegato è un catione di metalli alcalini, alcalino terrosi, metalli di transizione o lantanidi. Lo ione viene coordinato dagli atomi donatori dei reagenti, generando un templato ciclico stabile attorno al metallo che conduce alla formazione di un anello macrociclico come prodotto risultante. Lo ione influenza il processo strutturalmente, controllando l’orientazione spaziale e geometrica dei componenti, la cavità del macrociclo sarà fortemente influenzata dalle dimensioni dello ione, ma aiuta anche a stabilizzare l’intermedio di reazione favorendo la ciclizzazione. In Figura 5 è stata riportata la sintesi di Pedersen per il DB-18-corona-6, che utilizza lo ione sodio come templante. OH Cl Cl O OH NaOH (2 equiv.) O O O O O O Na+ O O O O O O Cl Figura 5 Sintesi di Pedersen per il DB-18-corona-6. 8 Self-Assembly. Processo a più step di reazione. Si può distinguere in molecolare o supramolecolare, se per la formazione del prodotto le specie di partenza vengono legate, rispettivamente, attraverso legami covalenti oppure vi è solamente un riconoscimento molecolare attraverso interazioni non covalenti e reversibili. Il processo di self-assembly è un processo spontaneo che regola l’organizzazione strutturale e spaziale del complesso, influenzandone anche la struttura tridimensionale. La reversibilità dei legami permette al sistema di equilibrare i diversi componenti e le diverse interazioni possibili, formando cosi la struttura termodinamicamente più stabile. Secondo Lindsey7 esistono diverse classificazioni di self-assembly: • Strict Self-Assembly: il prodotto finale si forma spontaneamente, quando i componenti sono mescolati secondo il rapporto di combinazione. La struttura del prodotto è il risultato diretto dell’assemblaggio dei suoi componenti, è inoltre reversibile e si trova in equilibrio termodinamico con i reagenti. • Self-Assembly Irreversibile: la sintesi del prodotto avviene per formazione di legami irreversibili tra i componenti di partenza, non sono ammessi margini d’errore e tutti i legami devono essere formati correttamente fin da subito. Il processo conduce quindi alla formazione del prodotto cinetico di reazione. • Modificazione Del Precursore E Successivo Self-Assembly: questo processo prevede ulteriori passaggi per la preparazione di un precursore, da utilizzare poi per il self-assembly. Un esempio può essere quello della preparazione del GTP per la formazione della tubulina, studi hanno dimostrato che le proteine adibite all’assemblaggio dei microtubuli necessitano una concentrazione minima di ioni Mg2+ per la corretta esposizione dei siti di legame tra le subunità tubulina-GDP.8 • Self-Assembly Con Post-Modificazioni: il prodotto assemblato richiede ulteriori modificazioni prima di poter essere utilizzato, solitamente per mezzo di un agente esterno. 9