UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Curso de Graduação em Farmácia ANE FRANCYNE COSTA NOVAS ABORDAGENS NO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE MICOSES: O sistema MALDI-TOF MS Florianópolis 2015 ANE FRANCYNE COSTA NOVAS ABORDAGENS NO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE MICOSES: O sistema MALDI-TOF MS Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação em Farmácia, apresentado ao Departamento de Análises Clínicas da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para conclusão da Disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso II Orientador: Prof. Jairo Ivo dos Santos Florianópolis 2015 AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a minha família por apoiar a minha escolha de ingressar em um curso tão desafiador e gratificante como é o curso de Graduação em Farmácia. A minha mãe Márcia Costa e a meu pai Dauri Aristote Costa por me incentivar a sempre perseguir meus sonhos, e por colaborar em todos os aspectos para a concretização da minha formação acadêmica. A minha avó Maria Lair Costa e a meu irmão André Felipe Costa e Costa por acreditar no meu potencial e me aconselhar em todos os momentos necessários. Agradeço especialmente aos professores do curso de Graduação em Farmácia por exigir minha dedicação ao estudo aprofundado das disciplinas ofertadas e por auxiliar na escolha do meu futuro como profissional farmacêutica. Aos amigos que fiz durante a Graduação pelos momentos de dedicação conjunta aos estudos bem como pelos momentos de descontração que tornaram esses cinco anos muito mais agradáveis. Estes certamente terão futuros brilhantes como farmacêuticos. Ao Laboratório Médico Santa Luzia que permitiu minha visita à rotina laboratorial do equipamento cujo qual abordarei no meu trabalho. Por fim, agradeço ao professor Jairo Ivo dos Santos por aceitar orientar meu Trabalho de Conclusão de Curso e por ser sempre prestativo no decorrer de sua elaboração. A todos, MUITO OBRIGADA! RESUMO Avanços na medicina nos últimos anos permitiram que houvesse um grande aumento na sobrevida de pacientes imunocomprometidos. Entretanto, isso levou também a um aumento significativo nas infecções fúngicas oportunistas sistêmicas, com quadros clínicos de alta morbidade e mortalidade. Isso pode ser atribuído ao número limitado de terapias eficazes e ao aumento da resistência a agentes antifúngicos nos últimos anos devido a tratamentos inadequados. Outro fator que contribui fortemente para o mau prognóstico dos pacientes é a dificuldade de se realizar diagnóstico precoce, que pode ser atribuída à falta de métodos diagnósticos suficientemente sensíveis e específicos. O diagnóstico laboratorial de micoses, atualmente, baseia-se na observação de elementos fúngicos retirados diretamente de amostras biológicas, na análise macroscópica e microscópica da colônia isolada, na detecção de resposta sorológica ao patógeno ou de algum marcador de sua presença e em provas bioquímicas. Além disso, avanços na biologia molecular permitem a análise da sequência gênica de fungos fenotipicamente parecidos. Essas técnicas, no entanto, apresentam algumas limitações, como o tempo de identificação, que pode levar de dias a semanas, produção insuficiente de anticorpos em pacientes imunocomprometidos, reações cruzadas com outras micoses nos testes sorológicos e falta de padronização e custo elevado nas técnicas de biologia molecular. Esses fatores podem levar a intervenção medicamentosa tardia ou equivocada, o que resulta em menor probabilidade de cura para o paciente. A análise de macromoléculas por Espectrometria de Massa por Tempo de Voo - Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS) surgiu no final dos anos 1980, como uma alternativa para automatizar e acelerar o diagnóstico no laboratório de microbiologia clínica. Utilizando o sistema MALDI-TOF MS, um microrganismo desconhecido pode ser identificado por comparação de seu espectro de massa com um banco de dados de espectros de referência (BDER). O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão da literatura sobre a aplicabilidade e limitações do sistema MALDI-TOF MS no diagnóstico de infecções fúngicas. A metodologia consistiu em realizar uma revisão da literatura do tipo integrativa, com análise sistemática das publicações relacionadas ao tema. A pesquisa bibliográfica foi realizada em livros, artigos científicos e monografias por meio de consulta às bases de dados MEDLINE (PubMed), ScienceDirect e Scielo. Conclui-se que o sistema MALDI-TOF MS já está sendo adotado em laboratórios de análises clínicas em todo o mundo, inclusive para o diagnóstico laboratorial de micoses, no qual leveduras e fungos filamentosos podem ser identificados, proporcionando resultados rápidos e precisos. Além disso, existe a possibilidade de se aplicar o sistema para determinar a suscetibilidade das amostras fúngicas aos antifúngicos. O custo por análise para o laboratório utilizando o sistema MALDI-TOF MS é reduzido, no entanto, o custo de aquisição do equipamento e gastos com manutenções podem limitar o seu uso na rotina laboratorial. Previsões futuras para aperfeiçoamento do sistema incluem redução do custo de aquisição do equipamento, melhoria nos BDER, construção de uma biblioteca pública de espectros de referência, e uso do método em análise direta de amostras biológicas. Palavras-chave: MALDI-TOF MS, fungos filamentosos, leveduras, diagnóstico laboratorial, micoses. ABSTRACT Medical advances in recent years allowed a large increase in the survival rate of immunocompromised patients. However, this also led to a significant increase in systemic opportunistic fungal infections, with clinical conditions of high morbidity and mortality. This can be attributed to the limited number of effective therapies and increased resistance to antifungal agents in recent years due to inadequate treatment. Another reason that strongly contributes for the poor prognosis of the patients is the difficulty to carry out early diagnosis, which can be attributed to the lack of sufficiently sensitive and specific diagnostic methods. Today, laboratory diagnosis of mycoses is based on the finding of fungal elements taken directly from biological samples, on macroscopic and microscopic analysis of the isolated colony, antibody response to the pathogen, detection of a marker of their presence and biochemical tests. Furthermore, advances in molecular biology allow the analysis of gene sequence of phenotypically similar fungi. These techniques, however, have some limitations, such as time of identification, which can take days or even weeks to accomplish, insufficient production of antibodies in immunocompromised patients, cross-reactions with other mycoses in serological tests, and lack of standardization and high cost of molecular biology techniques. These factors may lead to delayed or wrong drug intervention, which results in a lower chance for the cure of the patient. The macromolecules analysis by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI- TOF MS) emerged in the late 1980's as an alternative to automate and accelerate the diagnosis in the clinical microbiology laboratory. Using the MALDI-TOF MS system an unknown microorganism can be identified by comparing their generated mass spectra with a database of reference spectra (BDER). The aim of this study was to conduct a literature review on the applicability and limitations of the MALDI-TOF MS system in the diagnosis of fungal infections. The methodology consisted in carrying out a literature review of the integrative type, with systematic analysis of the publications related to the topic. Literature research was performed in books, scientific articles and monographs by searching the MEDLINE (PubMed), ScienceDirect and Scielo databases. We conclude that the MALDI-TOF MS system is already being adopted in clinical laboratories throughout the world, including those used for the diagnosis of mycoses, in which yeasts and filamentous fungi can be identified, providing fast and accurate results. Moreover, there is the possibility of application of the system to determine susceptibility to antifungal agents. The cost per analysis to the laboratory using the MALDI-TOF MS system is reduced, however, the cost of the equipment and the maintenance may limit its use in routine laboratory. Future improvements for the system include reduction of the acquisition cost of the equipment, improved BDER, construction of a public library of reference spectra, and direct analysis of biological samples. Keywords: MALDI-TOF MS, filamentous fungi, yeasts, laboratory diagnosis, mycosis. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Modelo esquemático de funcionamento do MALDI-TOF MS. Figura 2 – Equipamento que utiliza a tecnologia MALDI TOF MS – VITEK MS (bioMérieux). Figura 3 – Isolados de bactérias e leveduras sendo retirados da cultura primária. Figura 4 – Aplicação do isolado, extração com ácido fórmico, secagem e aplicação da matriz na placa de MALDI TOF MS. Figura 5 – Placa de MALDI TOF MS sendo colocada no suporte e posteriormente no equipamento para análise. Quadro 1 – Principais infecções micóticas que acometem os seres humanos no Brasil. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Matrizes comumente utilizadas no MALDI-TOF MS. LISTA DE SIGLAS AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária BDER – Banco de Dados de Espectros de Referência BHI – Infusão de Cérebro e Coração CHCA - Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute Da – Dalton DNA – Ácido Desoxirribonucleico ELISA – Imunoensaio enzimático FDA – Food and Drug Administration HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana kDa - Quilodalton LS – logscore MALDI-TOF MS – Espectrometria de Massa por Ionização/Dessorção à Laser Assistida por Matriz - Tempo de Voo MRSA – Staphylococcus aureus resistentes à meticilina MS – Espectro de Massa / Espectrometria de Massa M/Z – Relação Massa Carga OMPs – proteínas da membrana externa PCR – Reação em Cadeia da Polimerase UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina UV – Ultravioleta VRE – Enterococcus resistentes à vancomicina SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 7 2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 10 2.1 GERAL ..................................................................................................................... 10 2.2 ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 10 3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 11 3.1 HISTÓRICO ............................................................................................................. 11 3.2 DIAGNÓSTICO ATUAL DE MICOSES ................................................................ 13 3.3 MALDI-TOF MS ..................................................................................................... 20 3.3.1 Princípio do método ............................................................................................ 20 3.3.2 Aplicações ............................................................................................................. 25 3.3.3 Diagnóstico de micoses ........................................................................................ 29 3.3.3.1 Leveduras ........................................................................................................... 29 3.3.3.2 Fungos filamentosos ........................................................................................... 35 3.3.4 Comparação com outros métodos diagnósticos de micoses ............................. 40 3.3.5 Custo-benefício de implementação .................................................................... 43 3.3.6 Teste de sensibilidade a antifúngicos ................................................................. 45 3.3.7 Visita a um laboratório clínico que utiliza o MALDI TOF MS ...................... 47 3.3.8 Aplicações futuras ............................................................................................... 51 4 METODOLOGIA ...................................................................................................... 52 5 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 54 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 57 ANEXOS ....................................................................................................................... 73 7 1 INTRODUÇÃO Micologia é a ciência que estuda os fungos, que são seres vivos heterótrofos que possuem distribuição mundial. Eles contam com representantes macroscópicos, como os cogumelos, e com representantes microscópicos, como as leveduras e os fungos filamentosos (BENCHIMOL E SÁ; 2004). Ao longo do tempo, mais de 100.000 espécies de fungos foram reconhecidas e descritas. No entanto, menos de 500 destas espécies têm sido associadas com doenças em humanos, e não mais do que 100 são capazes de causar infecção em indivíduos saudáveis. O restante só é capaz de provocar doença em indivíduos debilitados ou imunocomprometidos (KAUFFMAN; 2011). Por outro lado, micoses sistêmicas são uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre pacientes imunocomprometidos, principalmente naqueles com distúrbios onco-hematológicos, câncer, receptores de transplante de medula óssea ou órgãos sólidos, e pacientes em terapia com agentes imunossupressores (DIGNANI; 2014). Entre 1996 e 2006, as micoses sistêmicas foram a décima causa mais comum de morte entre doenças infecciosas e parasitárias no Brasil. Além disso, dados mostraram que a paracoccidioidomicose foi a principal causa de morte entre as micoses sistêmicas, seguida por criptococose, candidíase, histoplasmose, aspergilose e zigomicose (PRADO et al.; 2009). Essa alta taxa de mortalidade decorre, em parte, do número limitado de terapias eficazes que estão disponíveis no mercado ou está relacionada à limitação de dose devido à toxicidade do tratamento medicamentoso. Além disso, devido a tratamentos inadequados, a resistência a agentes antifúngicos vem crescendo nos últimos anos (PFALLER; 2012). Outro fator que contribui para o mau prognóstico desses pacientes é a dificuldade de diagnóstico, principalmente devido à falta de testes suficientemente sensíveis (ALEXANDER; 2002; GUIMARÃES et al; 2006). O diagnóstico de infecções fúngicas depende de uma combinação de observações clínicas e laboratoriais. Ainda que algumas lesões superficiais ou subcutâneas possam auxiliar no processo diagnóstico, muitas vezes o diagnóstico laboratorial é necessário quando diferentes microrganismos podem causar quadros clínicos similares ou ainda quando a aparência das lesões se torna atípica devido a tratamentos prévios. No caso de micoses sistêmicas, a apresentação clínica muitas vezes