Linköping University Medical Dissertation No.1512 Targeting vascular remodeling in abdominal aortic aneurysm To identify novel treatment strategies and drug candidates Emina Vorkapić Division of Drug Research Department of Medical and Health Sciences Linköping University, Sweden Linköping 2016 © Emina Vorkapić, 2016 Cover design by Robert Vorkapić Published articles have been reprinted with the permission of the copyright holder. Printed by LiU-Tryck in Linköping, Sweden, 2016 During the course of the research underlying this thesis, Emina Vorkapić was enrolled in Forum Scientium, a multidisciplinary doctoral program at Linköping University, Sweden. ISBN 978-91-7685-821-9 ISSN 0345-0082 II “Start by doing what´s necessary; then do what´s possible; and suddenly you are doing the impossible” -Francis of Assisis III IV ABSTRACT Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a degenerative weakening of the aortic wall, mainly affecting elderly men with a prevalence of 4.4-7.7 %. AAA is characterized by medial and adventitial inflammatory cell infiltration associated with vascular remodeling of the extracellular matrix proteins such as collagen and elastin and with phenotypic modulation and loss of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Although much research has been performed, the precise cellular and molecular pathways behind these processes are still poorly understood. The overall aim of this thesis was to target signaling pathways that affect vascular remodeling of AAA to potentially identify novel strategies and drug candidates for future treatment of aneurysmal diseases. In order to develop our understanding of the pathophysiology of AAA, we used the angiotensin (Ang) II-induced AAA animal model and human biopsies taken at end-stage of disease to recapitulate key aspects of disease formation. Innate immune receptors such as toll-like receptors (TLRs) are known to regulate immunological processes leading to the formation and progression of vascular disease including AAA. In paper I, we aimed to investigate the role of TLR signaling under the control of the TRIF adaptor protein in the formation of AAA. Human, aneurysmal aortas displayed increased expression of TLR3 and TLR4 in surface of macrophages and T lymphocytes. AngII-induced aneurysm formation was attenuated in mice lacking the Trif gene (ApoE−/−Trif−/−), and these knockout mice presented with a more intact medial layer together with a reduced inflammatory response by macrophages and T lymphocytes and reduced levels of pro-inflammatory cytokines, chemokines, and proteases. Our results suggest an involvement of TRIF in the pathophysiology of AAA. Current management of AAA fully depends on imaging and surgical techniques, and drug- based therapies are still mostly ineffective. In paper II, we aimed to investigate the potential protective role of the tyrosine kinase inhibitor imatinib on the molecular mechanism involved in AAA formation. In AngII-infused ApoE−/− mice, 10 mg/kg imatinib per day affected several key features important in aneurysmal formation, including preservation of the medial layer of the VSMCs, reduced infiltration of CD3ε-positive T lymphocytes, and reduced gene expression of mast cell chymase, resulting in decreased aortic diameter and vessel wall thickness. These results highlight the importance of the tyrosine kinase inhibitor imatinib as a V potential drug in the treatment of pathological vascular inflammation and remodeling in conditions such as AAA. In paper III, we aimed to investigate the role of adiponectin in experimentally induced AAA formation in mice. In mice with elevated adiponectin levels, AAA development was inhibited, and this was associated with reduced inflammatory cell infiltration, reduced medial degeneration of VSMCs and of elastin in the aortic vessel wall together with an improved systemic cytokine profile and the attenuation of periaortic adipose tissue (PVAT) inflammation. These results support the protective effect of adiponectin in the remodeling occurring in the aortic wall and in the prevention of AAA. In paper IV, we performed a descriptive study investigating the composition of PVAT adjacent to the aneurysmal aorta. We used immunohistochemistry to identify neutrophils, macrophages, mast cells, and T lymphocytes surrounding necrotic adipocytes in PVAT together with increased gene expression of IL-6 and cathepsin K and S. We also determined the concentrations of pro-inflammatory ceramides in PVAT and found an association to T lymphocytes. These results suggest that inflamed adipose tissue might be a source of pro- inflammatory cells and mediators that contribute to aortic wall degeneration. VI POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING Pulsåderbråk är en sjuklig vidgning av ett blodkärl som vanligast drabbar stora kroppspulsådern i buken och kallas då för bukaortaaneurysm eller abdominalt aorta aneurysm (AAA). Ett AAA definieras utifrån en aortadiameter som är ≥ 30 mm. Sjukdomen förekommer oftast ihop med en underliggande åderförkalkning. Risken att drabbas av AAA är 4-6 gånger vanligare hos män än kvinnor med en prevalens på 4-7.7 % hos män över 65 år och 1.3 % hos kvinnor i samma ålder. De flesta som drabbas är omedvetna om det då aneurysm är symtomfria. Vidgningen av kärlet är exponentiellt som vid ett förvärrat tillstånd kan leda till bristning i kärlväggen vilket medför en mycket hög dödlighet. Eftersom AAA främst drabbar män erbjuds idag alla män vid 65 års ålder en ultraljudsundersökning, detta för att upptäcka AAA i tid och för att lägga in en förebyggande operation då en aortadiameter överskridit 50-55 mm. AAA är en kronisk inflammatorisk sjukdom med inflammation i aortakärlväggen som bidrar till att beståndsdelar i kärlväggen försvagas och bryts ner vilket leder till att elasticiteten och hållfastheten i kärlet försvinner. Där kärlväggen är som svagast bildas succesivt en vidgning och därmed ett aneurysm. Den underliggande orsaken som ligger till grund för utvecklingen av AAA är ännu oklart och ingen medicinsk behandling finns att tillgå. För att bättre kunna studera sjukdomsförloppen för AAA finns välbeprövade djurmodeller att tillgå. Dessa efterliknar många viktiga processer som det mänskliga aneurysmet har samt ger oss möjligheten att studera sjukdomsförloppet i ett tidigt skede av aneurysmutvecklingen. Delarbete I-III är baserade på djurförsök där AAA experimentellt framkallades genom frisättning av det inflammatoriska proteinet angiotensin (Ang) II från en osmotisk pump som inopereras under nackskinnet på mössen. Det övergripande syftet med denna avhandling riktar sig mot en öka förståelsen kring signalvägar involverade i omformning av kärlväggen som leder till utvecklingen av AAA. En ökad kunskap och förståelse kring mekanismerna bakom AAA ger oss förhoppningsvis möjligheten att identifiera nya behandlingsstrategier och läkemedelskandidater för framtida behandling av sjukdomen. VII Det är känt att inflammation är en av de starkt bidragande faktorerna till förvärring av AAA. I delarbete I studerades genen TRIF, ett intracellulärt protein som reglerar signalerna från immunreceptorerna TLR3 och TLR4, och dess roll i utvecklingen av AAA. Inflammationens roll i sjukdomsutvecklingen studerades genom avsaknad av genen hos möss samtidigt som AAA framkallats experimentellt med AngII modellen. De möss som saknade TRIF-genen var skyddade från utvecklingen av AAA vilket var starkt kopplat till ett minskat inflammatoriskt svar, med färre inflammatoriska celler och mindre inflammationstriggande faktorer i aortaväggen. Delarbete I ger en ökad förståelse för inflammationens roll med avseende på genen TRIF, i utvecklingen av AAA. Läkemedlet imatinib (Glivec®) är ett väl beprövat läkemedel som idag används vid behandling av maligna blodsjukdomar som kronisk myeloisk leukemi. Imatinib verkar genom att blockera processer som leder till utvecklingen av onormala celler. Studier visar att imatinib även har en inverkan på kroppens normala blodceller och har påvisat en förebyggande roll i utvecklingen av åderförkalkning hos möss. I delarbete II studerades behandlingseffekten av imatinib i AngII-framkallad AAA hos möss. De möss som behandlades med imatinib påvisade ett dämpat inflammatoriskt svar och en kärlstruktur som efterliknar den normala aortan. Delarbete II visar på att imatinib hämmar viktiga mekanismer och signaleringsvägar vid sjukdomsförloppet av AAA. En framtida strategi att använda läkemedlet för att bromsa inflammationsutvecklingen hos aneurysm patienter bör prövas i framtida kliniska studier. Adiponektin är ett hormon som produceras av fettceller och finns normalt cirkulerande i blodplasman. Kliniska studier visar ett samband mellan ökade nivåer av adiponektin och förbättrad insulinkänslighet vid typ 2 diabetes samt minskad vaskulär inflammation. I delarbete III studerades adiponektinets verkan på aneurysmutvecklingen genom att studera effekten av höga cirkulerande nivåer av adiponektin under utvecklingen av AngII-framkallad AAA hos möss. Adiponektinet hade en skyddande effekt mot utvecklingen av AAA vilket var starkt kopplat till minskad infiltration av inflammatoriska celler och inflammationstriggande faktorer i aortaväggen men även i fettcellerna som omger kärlväggen, samt bidrog till en stabilare kärlstruktur av bindvävsproteinerna elastin och kollagen. Delarbete III resulterade i en ökad förståelse av mekanismen bakom adiponektinets rollen i utvecklingen av AAA. VIII Våra inre organ täcks av fettvävnad som består av fettceller vars främsta funktioner är att lagra energi, reglera kroppstemperaturen samt bidra till en hormonell funktion däribland att utsöndra hormonet adiponektin. Men om fettvävnaden kring våra organ ökar i massa kan detta leda till en inflammerad och dysfunktionell fettvävnad som tidigare kopplats till en ökad tillväxt av AAA diametern. I delarbete IV studerades mänskliga kärl och kompositionen av inflammatoriska celler och inflammationstriggande faktorer i fettvävnaden som omger aortans yttre kärlvägg. Hos aneurysmpatienter förekom en ökad mängd fettvävnad som karaktäriserades av nekrotiska döda fettceller vilka var omgivna av inflammatoriska celler som neutrofiler, makrofager, mast celler och T celler. Hos aneurysmpatienterna påvisades även ökade nivåer av bindvävsnedbrytande enzymer. Resultaten i delarbete IV indikerar på en eventuellt bidragande roll av inflammerad fettvävnad i sjukdomsprocessen vid AAA. IX X