1 MONTPELLIER SUPAGRO ECOLE DOCTORALE SIBAGHE - SYSTEMES INTEGRES EN BIOLOGIE, AGRONOMIE, GEOSCIENCES, HYDROSCIENCES, ENVIRONNEMENT THESE Présentée pour l’obtention du titre de DOCTEUR EN SCIENCES Formation Doctorale : Biologie Intégrative des Plantes Présentée par Daniel RAMIRO CARACTERISATION DES MECANISMES DE RESISTANCE IMPLIQUES DANS LES REPONSES DU CAFEIER (Coffea arabica) A L’AGENT DE LA ROUILLE ORANGEE (Hemileia vastatrix). De la formation des haustoria à l’expression quantitative des gènes. Thèse dirigée par Diana FERNANDEZ Soutenue le 5 juin 2009 devant le jury composé de, Mme Fabienne BAILLIEUL Professeur, Faculté des Sciences, Reims Rapporteur Mme Maria do Céu SILVA Directrice de recherche CIFC, Portugal Rapporteur M Jean Loup NOTTEGHEM Professeur, Montpellier SupAgro Président Mme Diana FERNANDEZ Directrice de recherche, IRD, Montpellier Examinatrice M Sébastien DUPLESSIS Chargé de recherche, INRA, Nancy Examinateur 2 REMERCIEMENTS Je souhaite tout d’abord exprimer ma reconnaissance aux membres du jury, Madame le Professeur Fabienne BAILLIEUL, Madame Maria do Céu SILVA, Monsieur le Professeur Jean Loup NOTTEGHEM et Monsieur Sébastien DUPLESSIS, qui m’ont fait l’honneur de juger ce travail. Je remercie le Directeur Michel NICOLE pour son accueil au sein de l’UMR Résistance de Plantes aux Bioagresseurs (IRD – Montpellier). Je voudrais remercier chaleureusement Diana FERNANDEZ qui a su, par sa passion et son énergie, instaurer une bonne dynamique de travail. Qu’elle trouve ici l'expression de mon entière gratitude et le témoignage de mon amitié. Je la remercie également pour l'intérêt qu'elle a accordé à ce travail et pour son aide précieuse lors de la rédaction des manuscrits. Mes plus vifs remerciements vont à Anne-Sophie PETITOT qui m'a apporté ses connaissances et son amitié. Ses compétences et son enthousiasme m'ont soutenu sans cesse au cours de mes années de thèse. Qu'elle trouve ici ma reconnaissance et ma gratitude. Je remercie vivement tous ceux dont la collaboration a enrichi ces travaux, en particulier les membres des Comités de Thèse Messieurs Thomas KROJ, Jean Benoit MOREL, Alexandre de KOCHKO, Louis BERNIER et Sébastien DUPLESSIS. Avec sincérité, je remercie toute l’UMR RPB, notamment les thésards, pour l’amitié et le soutien au jour le jour pendant cette thèse. Je remercie également grandement Sylvie POUNHET dont le travail admirable m’a évité bien des déboires administratifs. Un très grand merci à Philippe MARMEY pour son aide inestimable lors de la rédaction de ce manuscrit. J’associe à ces remerciements M. Jamel ARIBI qui a préparé avec beaucoup de soins et d’attention le matériel végétal nécessaire aux expérimentations et sans lequel rien n’aurait été possible. Merci aussi à la Plateforme Montpellier Rio Imaging, spécialement à Jean-Luc VERDEIL, Jacques ESCOUTE et Geneviève CONEJERO pour l’aide qu’ils ont apportée sur toute la partie « microscopie ». Je tiens à remercier également Aida JALLOUL pour son aide précieuse dans les analyses biochimiques. Je remercie l’équipe du Instituto Agronômico de Campinas (IAC) au Brasil, particulièrement à Oliveiro GUERREIRO-FILHO et Miriam MALUF pour l’orientation avant et pendant le travail de thèse. Mes remerciements s’adressent autant à l’équipe du Centro de Investigação das Ferrugens do Cafeeiro (CIFC) au Portugal, particulièrement à Mesdames Maria do Céu SILVA, Leonor 3 GUERRA-GUIMARÃES et Helena AZINHEIRA qui m’ont fourni les spores d’H. vastatrix et des informations indispensables pour le déroulement de la thèse. Je tiens à remercier ma famille et en particulier mon épouse Silvia et mes enfants João Pedro et Luiza qui m'ont donné la force et le courage de continuer sur ce chemin. Enfin que toutes les personnes, qui de loin ou de près ont contribué à la réalisation de ce travail, trouvent ici l'expression de ma gratitude et de ma sympathie. 4 Montpellier SupAgro IRD Ecole Doctorale : SIBAGHE UMR Résistance des Plantes aux Bioagresseurs Caractérisation des mécanismes de résistance impliqués dans les réponses du caféier (Coffea arabica) à l’agent de la rouille orangée (Hemileia vastatrix). De la formation des haustoria à l’expression quantitative des gènes Résumé La résistance du caféier (Coffea arabica) à l’agent de la rouille orangée (Hemileia vastatrix) s’exprime par une réaction d’hypersensibilité (RH). Deux types de résistance (pré- et post-haustoriale) ont été décrits selon que la RH est déclenchée avant ou après la formation des haustoria, structures d’infection intracellulaire du champignon. L’objectif général de cette thèse vise la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans les résistances pré et post-haustoriale du caféier. Dans une première partie de la thèse, la caractérisation du processus infectieux par des approches histologiques, biochimiques et moléculaires, a révélé qu’H. vastatrix présentait une cinétique de développement différente de celle décrite jusqu’à présent. Dans les 24 heures suivant l’inoculation (hpi), des haustoria « pionniers » colonisent les cellules stomatiques. Cependant, la résistance spécifique de la plante ne s’exprime que lorsque des haustoria sont ensuite formés au niveau du mésophylle, à partir de 39 hpi. Dans une deuxième partie, les réponses de résistance du caféier dans les contextes de résistance pré et post-haustoriale ont été comparées. Les profils d’expression de gènes impliqués dans les réactions de défense, ou les voies de signalisation de la résistance, sont similaires dans les deux types de résistance. De plus, la voie dépendante de l’acide salicylique semble être activée dans les deux cas. Enfin, dans une troisième partie, l’analyse des gènes de la famille des facteurs de transcription WRKY a permis d’identifier des gènes pouvant jouer un rôle régulateur des réponses de résistance du caféier à la rouille. Mots clés : interactions hôte-parasite, résistance pré-haustoriale, résistance post-haustoriale, facteurs de transcription WRKY, gènes de défense, choc oxydatif Characterization of resistance mechanisms to orange rust (Hemileia vastatrix) in Coffea arabica. From haustorial formation to quantitative gene expression Abstract In coffee plants (Coffea arabica) resistance to the orange rust (Hemileia vastatrix) is expressed as a hypersensitive reaction (HR). According to the ability of plants to release the HR before or after the differentiation of haustoria, the fungus intracellular infection structure, two types of resistance were described (pre and post-haustorial). The objective of this thesis was the study of the molecular and physiological mechanisms controlling the expression of pre and post-haustorial resistance to H. vastatrix in coffee plants. In a first section of this work, histological, biochemical and molecular investigation of the infection process revealed that H. vastatrix displayed stages of growth not described before. 24 hours post-inoculation (hpi), so-called “pioneers” haustoria were seen inside stomata cells. However, specific resistance is expressed when haustoria are differentiated in mesophyll cells from 39 hpi. In a second part of the thesis, coffee resistance responses were compared in both pre and post-haustorial situation. Expression patterns of genes involved in the host defense, including signaling pathways, were similar in the two types of resistance. In addition, the salicylic acid pathway seems to be activated in both cases. Finally, in a third section, the analysis of the WRKY family of transcription factor allowed to identify genes putatively involved in the regulation of coffee resistance to the orange rust. Key words: host-pathogen interactions, pre-haustorial resistance, post-haustorial resistance, WRKY transcription factors, defence genes, oxidative burst 5 SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE ET OBJECTIFS DE LA THESE…………………….. 9 CHAPITRE I. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE.............................................. 12 1. La résistance des plantes aux bioagresseurs................................................................... 12 1.1. La reconnaissance : étape cruciale dans la mise en place de la résistance............... 12 1.1.2. Le concept de reconnaissance « gène pour gène »........................................... 13 1.1.3. Les gènes R....................................................................................................... 15 1.1.4. Les facteurs Avr des rouilles............................................................................ 16 1.1.5. Les modèles de reconnaissance R-Avr............................................................. 20 1.1.5.1. Deux principaux modèles de reconnaissance R-Avr.................................. 20 1.2. La résistance spécifique........................................................................................ 23 1.2.1. La signalisation précoce liée liée à la reconnaissance spécifique................... 24 1.2.1.1. La modification des flux ioniques.............................................................. 24 1.2.1.2. La production de formes réactives de l’oxygène........................................ 25 1.2.1.3. L’oxyde nitrique......................................................................................... 26 1.2.1.4. Les cascades MAPK................................................................................... 26 1.2.1.4.1. Les MAPK............................................................................................ 27 1.2.2. Signalisation hormonale de la résistance........................................................... 29 1.2.2.1. L’acide salicylique...................................................................................... 29 1.2.2.1.1. Les voies de biosynthèse du SA.......................................................... 29 1.2.2.1.2. Biosynthèse du SA et activation de protéines PR............................... 30 1.2.2.1.3. Le mode d’action du SA..................................................................... 30 1.2.2.1.4. Mobilité du signal de la SAR dans les plantes.................................... 34 1.3. Résistance Systémique Induite................................................................................ 34 1.3.1. Les jasmonates................................................................................................. 34 1.3.2. L’éthylène........................................................................................................ 36 1.3.3. Interactions entre JA et l’ET............................................................................ 38 1.4. Interactions entre les voies de signalisation du SA et des JA/ET........................... 38 1.5. Protéines PR............................................................................................................. 40 1.5.1. La famille de protéines PR-1............................................................................. 42 1.5.2. Les marqueurs des voies de signalisation.......................................................... 42 1.6. Les phytoalexines..................................................................................................... 43 2. Les rouilles..................................................................................................................... 43 2.1. Taxonomie............................................................................................................... 43 2.2. Cycle biologique...................................................................................................... 44 6 2.3. Mode d’infection...................................................................................................... 47 3. Le pathosystème caféier - Hemileia vastatrix............................................................... 52 3.1. Le caféier.................................................................................................................. 52 3.1.1. Importance économique et sociale..................................................................... 52 3.1.2. Classification botanique et mode de reproduction............................................. 52 3.1.3. Ressources genomiques..................................................................................... 55 3.2. La rouille orangée..................................................................................................... 55 3.2.1. Taxonomie.......................................................................................................... 56 3.2.2. Biologie d’H. vastatrix....................................................................................... 56 3.2.3. Interactions spécifiques entre Coffea spp. et H. vastatrix................................. 59 3.2.4. Processus infectieux et réponses de résistance du caféier à H. vastatrix........... 62 PRESENTATION DE LA THESE................................................................................... 69 CHAPITRE II. ARTICLE I: BIPHASIC HAUSTORIAL DIFFERENTIATION OF COFFEE RUST (HEMILEIA VASTATRIX RACE II) ASSOCIATED WITH DIFFERENTIAL DEFENCE RESPONSES IN RESISTANT AND SUSCEPTIBLE COFFEE CULTIVARS …………………………………………………………………. 72 CHAPITRE III. LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION DU TYPE WRKY............... 98 1. Introduction.................................................................................................................... 98 1.1. Les facteurs de transcription................................................................................... 98 1.2. Les facteurs de transcription du type WRKY......................................................... 98 1.2.1. Le domaine WRKY.......................................................................................... 100 1.2.2. Distribution et évolution de la famille WRKY................................................. 102 1.2.3. Un mode général d'action.................................................................................. 105 ARTICLE II. GENE EXPRESSION PROFILING OF COFFEA ARABICA WRKY TRANSCRIPTION FACTORS IDENTIFIES PUTATIVE REGULATORS OF PATHOGEN RESISTANCE............................................................................................. 107 CHAPITRE IV. CARACTERISATION DE LA REPONSE SPECIFIQUE DU CAFEIER LIEE AUX RESISTANCES PRE ET POST-HAUSTORIALES.................... 144 CONCLUSIONS GENERALES........................................................................................ 172 PERSPECTIVES………………………………………………………………………… 176 MATERIEL ET METHODES........................................................................................... 178 7 1. Matériel végétal.............................................................................................................. 178 1.1. Description des variétés utilisées............................................................................ 178 1.2. Culture des plantes................................................................................................. 179 1.2.1. Au Brésil, à l’IAC............................................................................................ 179 1.2.2. A Montpellier, à l’IRD.................................................................................... 179 1.3. Stades physiologiques étudiés................................................................................. 179 2. Matériel phytopathogène............................................................................................... 180 2.1. Isolats d’H. vastatrix utilisés dans les essais........................................................... 180 2.2. Multiplication de la rouille orangée (souche 1427)................................................. 181 3. Techniques mises en oeuvre........................................................................................... 181 3.1. Techniques d’inoculation des plantes...................................................................... 181 3.1.1. Inoculation de la rouille orangée..................................................................... 181 3.1.2. Inoculation par des nématodes........................................................................ 182 3.2. Vérification de la germination des spores............................................................... 182 3.3. Traitements abiotiques............................................................................................. 182 3.4. Évaluation de la résistance des plantes sélectionnées............................................. 183 3.4.1. Type de réaction.............................................................................................. 183 3.5. Analyse histologique.............................................................................................. 183 3.5.1. Méthodologie utilisée...................................................................................... 184 3.6. Analyses moléculaires............................................................................................. 185 3.6.1. Analyse bio-informatique........................................................................... 185 3.6.2.1. Regroupement hiérarchique des ESTs................................................. 185 3.6.3. Extraction d’ARN total et RT-PCR........................................................... 186 3.6.4. RT-PCR en Temps Réel............................................................................. 187 3.6.4.1. Généralités........................................................................................... 187 3.6.4.2. Méthodologie adoptée......................................................................... 188 3.6.4.3. Analyse des données de qPCR............................................................ 189 3.7. Préparation des cinétiques caféier/H.vastatrix étudiées.......................................... 190 3.7.1. Essai expérimental pour l’analyse de l’expression de gènes candidats dans l’interaction incompatible Caturra x H. vastatrix race VI............................. 190 3.7.2. Essai expérimental pour l’analyse de l’expression de gènes candidats chez les variétés Catuai et Tupi inoculées avec la race II d’H. vastatrix.............. 191 3.8. Evaluation de l’accumulation du peroxyde d’hydrogène dans les feuilles de caféiers................................................................................................................... 191 4. Analyses statistiques...................................................................................................... 192 8 BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................ 193 ANNEXE 1. EVALUATION DE LA VARIABILITE NATURELLE DE L’EXPRESSION DES GENES SELECTIONNES........................................................... 216 ANNEXE 2. USE OF LEAF-DISK TECHNIQUE FOR GENE EXPRESSION ANALYSIS OF THE COFFEE RESPONSES TO HEMILEIA VASTATRIX INFECTION……………………………………………………………………………... 220 ANNEXE 3 - LA RESISTANCE PARTIELLE DE LA VARIETE ICATU.................... 226 9 INTRODUCTION GENERALE ET OBJECTIFS DE LA THESE Le café, avec une production mondiale de 118 millions de sacs (60 kg) en 2007, est un des produits agricoles les plus commercialisés, occupant la deuxième place, après le pétrole, dans le commerce international (International Coffee Organization, 2007). La culture du caféier (Coffea arabica L.) ainsi que les activités liées à la commercialisation du café fournissent un emploi à des millions de personnes dans le monde entier. Les principales variétés de C. arabica cultivées sont hautement productives, produisent un café de bonne qualité, mais se sont révélées sensibles à de nombreux parasites. La rouille orangée, causée par le champignon Basidiomycète Hemileia vastatrix Berk. & Br., peut être considérée comme la plus grave maladie du caféier et une des sept plus importantes maladies et pestes des plantes tropicales dans le monde (Kushalappa et Eskes, 1989). A présent, la rouille orangée est répandue dans toutes les régions de culture du caféier et les principales variétés de C. arabica cultivées (Bourbon, Typica, Mundo Novo, Caturra) sont très sensibles aux races d’H. vastatrix les plus communes. Actuellement, on dénombre plus de 45 races du parasite et au moins neuf facteurs de résistance ont été génétiquement caractérisés à ce jour chez la plante (Rodrigues et al., 1975; Bettencourt et Rodrigues, 1988; Varzea et al, 2005). Depuis une cinquantaine d’années, les schémas d’amélioration du caféier pour la résistance à la rouille ont privilégié la voie génétique, avec pour objectif l’obtention de variétés de caféiers résistantes et conservant une production élevée, ainsi qu'une bonne qualité à la tasse (Van der Vossen, 2001). Malheureusement, l’introduction de facteurs de résistance s’accompagne généralement de facteurs génétiques défavorables à la qualité (Bertrand et al., 2003). Par ailleurs, la plupart de ces gènes sont hautement spécifiques et susceptibles d’induire une sélection de populations de parasites capables de contourner cette résistance. Ainsi, en quelques années, tous les gènes de résistance sélectionnés ont été surmontés, mettant en évidence la nécessité de développer des variétés présentant une résistance plus durable à la rouille (Varzea et Marques, 2005). Pour atteindre cet objectif, une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, génétique et cellulaire qui participent à la résistance du caféier est indispensable. La résistance des plantes est fondée sur l’existence d’un répertoire de molécules de reconnaissance spécifiques des parasites. Les protéines codées par les gènes de résistance (gènes R) servent de base à un système de surveillance mis en place par la cellule végétale pour lutter contre l’infection microbienne (Takken et al., 2006). La reconnaissance spécifique d’effecteurs du parasite, codés par les gènes d’avirulence (gènes avr), permet le 10 développement très rapide d’une réaction d'hypersensibilité (HR) qui protège totalement la plante de l’agent pathogène (Jones and Dangl, 2006). Récemment, il a été démontré chez la rouille du lin, que les protéines avr de Melampsora lini sont secrétées dans la cellule végétale par les haustoria (Dodds et al., 2004; Catanzariti et al., 2006). Les haustoria sont des structures fongiques hautement spécialisées qui permettent d’établir une relation de biotrophie entre l’hôte et le parasite, ce dernier puisant ainsi directement dans les cellules végétales les réserves nutritives nécessaires à sa croissance tout en supprimant les mécanismes de défense de la plante (Catanzariti et al., 2007; Dodds et al., 2004; Voegele and Mendgen, 2003). Dans la plupart des interactions plante/rouille étudiées, la résistance de la plante de type HR s’exprime après la différenciation des haustoria chez le parasite (Heath, 1997). Chez le caféier, une résistance post-haustoriale est observée dans l’interaction incompatible S4Agaro (facteurs de résistance SH4, SH5) / race II (Silva et al., 2002), mais pas dans l’interaction incompatible Caturra (facteurs de résistance SH5) / race VI où la croissance d’H. vastatrix est stoppée peu après la pénétration du champignon dans la cavité sous-stomatique, sans formation d’haustorium (Ganesh et al., 2006). Ce phénotype de résistance pré-haustorial se rapproche de ce qui est classiquement décrit dans les interactions non-hôte chez les rouilles (Heath, 1997), et est très intéressant, puisque les évènements mis en jeu sont déclenchés suffisamment tôt pour empêcher la différenciation de structures d’infection intracellulaires par le parasite. La mise en évidence de ces deux phénotypes de résistance, différant par la vitesse de réaction de la plante, montre qu’il existe une diversité de réponse du caféier à la rouille et suggère que les mécanismes de résistance du caféier à la rouille sont différents selon les gènes de résistance considérés. Par ailleurs, il est bien connu que le caféier peut aussi présenter une résistance de type quantitatif (ou résistance partielle) à la rouille, s’exprimant par des niveaux variables de sporulation chez les plantes sensibles (Kushalappa et Eskes, 1989). Dans ce type de résistance, les mécanismes de défense mis en jeu ne sont pas contrôlés par des gènes R spécifiques, mais par des gènes plus généraux de défense qui contribuent à la production de composés anti-microbiens et au renforcement des barrières naturelles de la plante pour lutter contre l’infection. Dans ce contexte, les objectifs généraux de la thèse visent à contribuer à la compréhension des mécanismes impliqués dans la résistance et l’activation des réactions de défense du caféier à H. vastatrix. Plus précisemment, cette étude aborde, par des approches cytologique et moléculaire, la résistance du caféier à la rouille dans 2 contextes différents : celui d’une résistance pré-haustoriale, et celui d’une résistance post-haustoriale, afin de vérifier si les mécanismes de résistance sont différents.