云 南 植 物 研 究 9##"，:;（,）：,,-\,89 "/.& <+.&%*/& =4%%&%*/& 刚毛柽柳天然居群遗传多样性初探! 张 娟，尹林克，张道远 （中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆乌鲁木齐 !"##$$） 摘要：柽柳是荒漠地区主要的灌木资源树种。以刚毛柽柳为代表，运用%&’(技术分析了广 布于新疆境内)个刚毛柽柳（!"#"$%&’%()%*" *+）天然居群的遗传多样性及居群间的遗传分 化。$#条随机引物检测到$,-个可重复的位点，其中多态位点$,,个，占总位点数的)!.-/。 由0123343表型多样性指数和567基因多样性指数估计居群间遗传分化百分比分别为89.,/ 和,,."#/，表明刚毛柽柳种内的遗传变异主要存在于居群间。根据以上结果，我们认为新 疆境内刚毛柽柳天然居群的遗传多样性很丰富，居群间分化程度较高；繁育系统属于一种自 交和不完全异交混合的交配类型；形成并维持其分布格局的主要因素是基因流的隔离。 关键词：刚毛柽柳；%&’(；遗传多样性；遗传分化 中图分类号：:);" 文献标识码：& 文章编号：#9,"<9-#（# 9##"）#,<#,,-<#8 !"#$ "%&’()*) +% ,-%-.*/ $*0-1)*.( +2 3&.41&’ #+54’&.*+%) +2 !"#"$%& ’%()%*" =>&5? @A23，BC5 *73DE6，=>&5? (24DBA23 （+%,-%",./,(0%01023456373.8",*923.$")’8，:’%,2(2;6"*2#834<6%2,62(，FGAHI7!"##$$，J1732） "6).1&/.：K17LM2M6GN6LOG7P6NQ16R636Q7ON7S6GL7QT23NM4MAU2Q743R636Q7OLQGAOQAG64V !.’%()%*" *+ 73 W73X723RY7Q1Q16H6Q14N 4V %&’(+ K16 Q63 G23N4H MG7H6GL O14L63 V4G 232UTL7L N6Q6OQ6N$,- G6M62Q2PU6 U4O773Y17O1$,,Y6G6M4UTH4GM17O+ K16MG4M4GQ7434VM4UTH4GM17OU4O7Y2L)!.-/+ K16R636Q7OLQGAOQAG6 4V M4MAU2Q7436LQ7H2Q6NPT0123343’LM1634QTM7ON7S6GL7QT73N6Z23N567’LR636Q7O73N6ZY6G689.,/ 23N ,,."#/+ CQLQ2Q6LQ12QH4LQ4VQ16S2G72Q7434OOAGG6N2H43RN7VV6G63QM4MAU2Q743L+ [62UL4V4A3NQ12QQ16 R636Q7ON7S6GL7QT4V !.’%()%*" 73 W73X723R Y2L 17R1+ CQ H7R1Q P6 NA6 Q4 N7VV6G63O6 4V L7QA2Q743L 23N U4Y R636VU4Y+ K17LLM6O76L7L2H7Z6NDH2Q73RQTM6+ 7-(8+19)：!"#"$%&’%()%*"；%&’(；?636Q7ON7S6GL7QT；?636Q7ON7VV6G63Q72Q743 刚毛柽柳（!"#"$%& ’%()%*" *+）是柽柳属（!"#"$%& *+）植物中最耐盐碱的种类之一， 在新疆分布范围最广，生态适应性很强，生态幅度颇宽，在荒漠区冲积、淤积平原和河漫 滩、湖盆边缘的潮湿和松陷盐土上，以及盐碱化草甸和砂丘低地上皆能生长（中国植物志 编委会，$)-)）；具有耐干旱、抗盐碱、耐贫瘠、耐风蚀沙埋等优良性状，是防风固沙、 ! 基金项目：中国科学院“生物区系特别支持费”项目及中国科学院“西部之光”项目（))9##"） 收稿日期：9##"<#9<$8，9##"<#,<$,接受发表 作者简介：张娟（$)-!<）女，硕士研究生，主要从事植物分子生态学研究。]<H27U：^X9##9L27L27_L732+ O4H ##& 云 南 植 物 研 究 $#卷 造林绿化、水土保持的优良树种，对改造沙漠气候具有重要的意义；是荒漠、半荒漠地区 主要的燃料、肥料及饲料来源，并可作染料和香料、还可入药，具有广泛的经济和药用价 值（刘铭庭，!""#）。作为荒漠地区主要的灌木资源树种，长期以来对本属植物的研究多 集中在形态解剖（魏岩等，!"""）、生理生态（曾凡江等，$%%$）、植物化学（程争鸣等， $%%%）、细胞学（翟诗虹，!"&’）等方面，试图以此揭示柽柳属植物由于即可自花授粉又 可异花授粉而造成的种内、种间的遗传多样性，但从种子形态、花粉形态、染色体方面的 研究结果均表明无法区分种内、种间的遗传分化及变异大小。 ()*+（!"#$%& ’&()*+*,$ -%).&%/(0*1 +,)，随机扩增多态性 +,)）分子标记自!""%年 问世以来，以其简便、快速、经济的优点被广泛应用于遗传多样性和保护生物学中，在检 测、确定物种或种群内的基因结构组成、变异及其种间的遗传和进化关系方面，显示出了 巨大的潜力（-.//.012，!""%）。 本文应用()*+技术对分布在新疆的刚毛柽柳居群内、居群间的遗传分化及遗传结构 的进行初步研究，旨在揭示其遗传多样性的水平，为种质资源的合理利用和荒漠区抗性基 因的筛选与克隆提供依据。 ! 材料和方法 !"! 实验材料 植物材料采自新疆境内"个天然分布的居群：)3 库尔勒—轮台；43 塔里木河流域；53 轮南；+3 新和—阿克苏；63 阿拉尔—阿克苏；73 阿克苏—巴楚；83 库车—轮台；93 尉犁；:3 焉耆盆地。伴 生种多为盐爪爪（2")*$*3& +%)*"43&）、胖姑娘（2"/,)*#*" 1"5(*1"）、盐穗木（6")%54"10.5 1"5(*1"）、骆驼刺 （’)0"7*5("/5*+%)*"）、碱蓬（83",$"7)"31"）等，每个居群分单株隔!#%1采集$%;<%株当年生绿色营养小 枝及小叶，野外迅速用硅胶干燥。 !"# 实验方法 !=$=! +,)的提取 采用高盐低 >9法提取基因组 +,)（邹喻萍等，!""?；张娟等，$%%<）。+@$%%%A !#%%%作为+,)B0CDEC，!FG)6（>9&=%）为电泳缓冲液，&%H电压下，以%=IJ琼脂糖凝胶电泳（%=# KLM1/的溴化乙锭染色）检测提取的基因组+,)片段的大小及纯度；NHOI$!型紫外分光光度计下分别 测定) 和) 值，检测+,)的浓度，O$%P保存。 $’% $&% 表! 用于$%&’分析的随机 !=$=$ 引物筛选 从’%条Y0RLTR公司的随机引物中筛选出!%条扩增 引物及序列 产物稳定、重复性好的引物对所有个体的基因组+,)进行扩增。引物 G0Q/E! (0RST1T/.LTRKU/ETV.SE 序列见表!。 >C.1EC20RS2EWKERUE2 !=$=< ()*+扩增及产物分离 通过 *5(反应参与物的浓度梯度实 引物 序列#X!<X 验，优化反应条件，最终确定反应体系的总体积为$#!/，包括：!%F *C.1EC YEWKERUE#X!<X Y!$! )588)G55G8 4KZZEC（BL$A 7CEE）$=#!/；BL5/$ $11T/M@；G0W+,)聚合酶!N；*C.1EC Y!<$ )588G)55)8 $=#!1T/M@；S,G* B.[VKCE !#%!1T/M@；模板 +,) <RL;’RL；SS9$\补 Y!?’ ))8)5555G5 Y!?I )8)G85)855 足，反应混合物用$%!/的液体石蜡覆盖。*5(扩增程序为："#P预变 Y!#" )58858G)G8 性$1.R；"?P变性?%2，<’P退火!1.R，I$P延伸$1.R，?%个循环； Y!’% ))588G8)55 最后I$P延伸I1.R。 Y!I$ )8)8885)5) Y!I< 5G88885G8) *5(扩增试剂均选用上海 Y0RLTR生物工程公司产品，在 *6(]:, Y!I? G8)588588G 6@B6(公司8ERE)1>GB*5( Y^2VE1$?%%型热循环仪中进行。扩增产 Y!I# G5)G558)88 HLF 云 南 植 物 研 究 EH卷 表! 由"#$%%&%指数估计的居群内、居群间遗传多样性及遗传分化 !"#$%& ’%(%)*+,*-%./*)01*)2*("(,"34(56467$")*4(/48 !9"#$%#&’ %/)*3")%,#0:2"((4(’*(,%; 6.*3%. < = > ? @ A ’ B C B646 B/6 ! " :DED F9FFF E9DF& &9EGD G9HD& E9HEI G9DHJ G9KGL G9IHL E9GGG &9DKK I9KIJ F9&LD F9L&J :D&E F9KJJ D9LLJ D9JHG E9JFE D9IEJ F9&KH F9I&K E9HGL D9IKH D9LG& G9JEI F9&&& F9LLK :DGL D9FKG E9JID &9LGL E9EID &9JEH &9&HH E9HI& D9KKJ G9FHH E9IH& I9&HD F9&GE F9LHI :DGK D9JIH E9HGL D9LH& E9LHG D9KJD D9IGI F9IGE D9I&H E9&FK D9JGF H9GIL F9&HG F9LGL :DHJ E9FJI &9GFG G9FKK D9IKI &9HKG E9GFL D9GLK D9&HH E9HKG E9H&K G9JD& F9HDL F9GIG :DLF E9KFG D9EKJ E9DIH G9GI& &9FE& D9IFE F9I&K E9LED &9LEJ E9HFK L9HHE F9&I& F9LDK :DKE D9GEG G9EDH D9KHF E9FEI E9IHE F9GIF D9GLK E9FLD E9LIE E9DFK H9DFH F9GD& F9HIK :DK& D9LKG D9DJJ E9DJH D9KFH E9&IG F9&&K E9DEI D9I&H E9GGH D9KLK L9DID F9EIL F9KDG :DKG F9LIL &9GIF D9GIF E9EJD E9&HI E9&EJ D9FGL D9&LI E9LJH D9JKF G9GID F9GGF F9HLF :DKH E9GLH E9HGE E9HJF &9HLE &9DFI F9H&D F9FFF D9GIF D9&DK D9JHH H9FDJ F9&JF F9LDD M%"( D9GJD E9HGE E9GKK E9I&F E9K&K D9KLE D9HJH E9DK& E9LFE E9EGL H9JID F9&KL F9LEH 注：B646（居群内遗传多样性，N*)2*(O6467$")*4(5%(%)*+,*-%./*)0）；B/6（总遗传多样性!4)"$5%(%)*+,*-%./*)0） !（B646PB/6，居群内遗传多样性所占比率6.464.)*4(485%(%)*+,*-%./*)01*)2*(O6467$")*4(）；"（（B/6—B646）PB646，居群 间遗传多样性所占比率6.464.)*4(485%(%)*+,*-%./*)0"34(56467$")*4(/）Q ’(! 由)*+指数估计的种群基因多样性 所研究的群体为随机交配群体，因此可以假定为 B".,0ON%*(#%.5平衡群体，根据 B".O ,0ON%*(#%.5平衡定律，采用R%*基因多样性指数对J个刚毛柽柳群体内、群体间基因多样 性和遗传分化进行计算。 结果表G，可以看出各居群内平均基因多样性值在F9DFFLSF9DIF&之间。居群内基因 多样性（B ）平均为F9DGL，种内基因多样性（B ）为 F9&EK，群体间的遗传分化系数为 ( ! HH9&FT。就种群分化程度而言，R%*指数的估计值要稍低:2"((4(指数估计的LE9HT。 表, 刚毛柽柳居群内、居群间基因多样性及遗传分化（由R%*指数估算） !"#$%G ’%(%)*+,*88%.%()*")*4("(,5%(%,*-%./*)01*)2*("(,"34(56467$")*4(/48 !9"#$%#&’ 6.*3%. < = > ? @ A ’ B C B( B! ?(! ’(! :DED F9FFFF F9DFKD F9DGEJ F9DIJF F9DDLD F9DLJL F9DJKJ F9EEGK F9DEIF F9DGDK F9&GJL F9EFKJ F9HJGK :D&E F9FGJD F9FJLF F9D&IG F9EFJI F9DFJG F9FDHL F9FHIF F9DKL& F9DD&I F9DFKG F9EIJE F9DIDI F9LEIL :DGL F9DLDH F9ELHL F9EIIE F9EDFD F9&&&& F9EIIE F9EHFF F9EDFD F9&DLF F9EHID F9GIID F9E&FF F9GKDE :DGK F9DDD& F9DHG& F9FJJL F9DHL& F9DE&F F9DFHH F9FHEK F9DDD& F9DHL& F9DDIJ F9&DGK F9DJHK F9LEED :DHJ F9DLKG F9EDII F9EGHH F9DEKE F9EFKL F9DHL& F9FJDH F9FJ&I F9DHGF F9DLEH F9EIGK F9DEEE F9GEJG :DLF F9DDID F9FKDE F9D&DJ F9EDH& F9DGKL F9DFGE F9FHED F9D&IJ F9EEEE F9D&&H F9EIGI F9DHD& F9H&DE :DKE F9DD&F F9EJ&& F9FJD& F9DGJF F9ED&J F9FGHK F9FJIL F9D&JG F9EFJD F9DHFG F9&FIL F9DHIE F9HDEL :DK& F9FJDH F9FKHJ F9DIFI F9D&DK F9DKDJ F9F&D& F9D&DK F9DEKE F9DIH& F9DEHE F9&KEH F9EGKE F9LL&I :DKG F9FGEG F9EF&D F9DD&I F9DLKG F9DKIL F9DGHD F9FIKD F9DFFG F9EFJI F9D&IL F9EJF& F9DHDK F9HEEG :DKH F9DHED F9DGHI F9DKFI F9E&D& F9EFED F9F&D& F9FFFF F9FJKJ F9DFED F9DEHJ F9EIJE F9DL&& F9HLGL M%"( F9DFFL F9DL&D F9DLF& F9DKIK F9DIF& F9DFJ& F9DFEF F9DGEF F9DKJK F9DGLE F9&EKE F9DIFJ F9HH&F 注：B （群体内基因多样性5%(%,*-%./*)01*)2*(6467$")*4(/）；B （总基因多样性)4)"$5%(%,*-%./*)0）；? （居群间基因多 ( ! (! 样性5%(%,*-%./*)0"34(56467$")*4(/）；’ （遗传分化系数5%(*)*+,*88%.%()*")*4(+4%88*+*%()）。 (! ! 讨论 （D）刚毛柽柳群体的多态位点百分率（)）很高，表明刚毛柽柳是变异很丰富的树种。 1期 张 娟等：刚毛柽柳天然居群遗传多样性初探 1/+ （!）"#$指数和 %&’(()(指数由于统计方法的原理不同，不可避免的在对居群间遗传 分化系数的估算上存在偏差（夏铭等，!**+），但二者揭示结果是一致的，即新疆境内刚 毛柽柳遗传多样性很丰富，居群间遗传分化的水平要略高于居群内。 （,）天然居群的遗传变异是基因流和选择共同作用的动力过程（赵桂仿等，!***）。 高水平、稳定的基因流可以防止居群间的遗传分化，使居群趋向于一致，低水平的基因流 易造成居群对局部环境的适应；而选择则可以不顾基因流的压力而支持在不同种类组成的 环境里适应的基因型。同种植物各个居群空间上的隔离、突变、环境因子造成的选择差 异、随机遗传漂变、基因流的隔离等都能导致居群基因结构的空间异质性，从而促进居群 的分化。刚毛柽柳为两性花，花非常小且密集，依靠风和昆虫传粉，本研究所选用的居群 之间和个体之间的地理距离又很大，这使得花粉的有效传播距离有可能小于居群间的地理 距离，使得居群内基因交流频繁，而居群间很难进行基因交流，造成居群间较高的遗传分 化水平。所以笔者认为维持刚毛柽柳遗传多态现象的机制可能主要是基因流的隔离。 （-）刚毛柽柳的繁育机制：王洪新（+../）认为对居群内、居群间遗传多样性的分配 唯一肯定起作用的是繁育系统。自交植物 ! 大于*01+，这样的群体趋向于形成一个内部 "# 均一而互相异质的小群体；异交植物的花粉散布的很远，强大的基因流促进了其居群间的 基因交换，以风媒异交为主的群体 ! 为*0+*，以虫媒异交为主的群体 ! 为*0!+。本研 "# "# 究得到刚毛柽柳居群间遗传分化系数在*0-!.-2*0//,3之间，平均为*011,*，可以看出基 本符合自交植物的特点，但又有少量的异交成分，因此可以基本认为刚毛柽柳的繁育系统 属于一种自交和不完全异交混合的交配类型。这也与其两性花、即可自花授粉又可异花授 粉的生殖生物学特性相符合。 （1）分析位点数的多少与所提供信息的量和可靠性之间明显相关。位点数达到4*个， 得到的遗传信息就比较可靠（周泽扬等，+..3）。本研究得到刚毛柽柳的位点数 +14 个， 足以满足5678的统计分析。 遗传变异的水平在某种程度上表明了该物种对环境适应的广泛程度，刚毛柽柳天然居群 的遗传多样性丰富，遗传分化较大。本研究发现，每个居群都有特异片段，这是否是其适应 不同的生态条件，对恶劣环境、特别是对新疆极端环境的响应，还需进一步的研究证实。 致谢 本实验是在新疆大学生命科学院张富春教授的自治区植物资源重点开放实验室完成。 〔参 考 文 献〕 中国植物志编委会，+.4.9 中国植物志第1*卷［:］9 北京：科学出版社，+-!—+-, 刘铭庭，+..19 柽柳属植物综合研究及大面积推广应用［:］9 兰州：兰州大学出版社，-/ ;&#(<=:（程争鸣），7’(>?（潘惠霞），@$(AB（尹林克），!***9 %CDEF)(C&#G&FC)H&#I$JCKFC’L)()IF)M #$%$&’( A$((’(E )*&’+$&’$ 8#JN［O］9 ,+-$./-./&0$1P2++’304-"’4（西北植物学报），!"（!）：!41—!3! B$(<A:，%H&’’Q R6，+.3.9 5$S)J)I’QT8"6 N’K$’C$)( ’(E E$JCK$SDC$)( $( 56370+8’$ %’99/6&’049’9［O］9 :;/16-’/4，#$（1）： +++4—+++. "#$:，+.4,9 6(’QFJ$J)M<#(#E$N#KJ$CF$(JDSE$N$E#EG)GDQ’C$)(J［O］9 <&/+=$-1,+$3>",，%"：,,!+—,,!, U’(<>?（王洪新），>D=6（胡志昂），+../9 7Q’(CSK##E$(<JFJC#I，<#(#C$HJCKDHCDK#’(EH)(J#KN’C$)()M<#(#C$HE$N#KJ$CF［O］9 M#! 云 南 植 物 研 究 !M卷 !"#$%&%’#()#*%+&#,-（生物多样性），!（!）："!—"# $%&’（魏岩），’&()*（尹林克），+,(-’（谭敦炎），."""/ +0%1&23422&5(25(60%,(,657&3,826943649%5:8%,:,(1&626,;5(57< &39%8,6&5(20&=5:+,7,9&3,3%,%&(>0&(,［?］/ ./,0’(,’(+%01@2//#)%$,3#$（西北植物学报），"#（.）：..A—..B $&88&,72?C，*4D%8&EFG，)&H,E*?，.""I/ -JF=58K759=0&272 ,7=8&:&%1 DK ,9D&69,9K =9&7%92 ,9% 42%:48 ,2 L%(%6&3 7,9E%9［?］/ 45/1./#)&6%&，"$：#MA.—#MAM N&,O（夏铭），P054NQ（周小峰），P0,5R-（赵士洞），!II./ GFS-,(,8K2&25(L%(%6&31&H%92&6K5:(,649,8=5=48,6&5(25: 7#8 $5&9(+0#%$&#&［?］/ ./,0:/(13#$（生态学报），%"（M）：TAI—TAT P%(LQ?（曾凡江），P0,(LNO（张希明），)&NO（李小明），!II!/ F9%H&%U5(60%U,6%9=0K2&585L&3,830,9,36%9&26&325:;0<0+#= ,(1&62=952=%36［?］/ !"#$>.??1:/(1（应用生态学报），"&（M）：#..—#.V P0,&RW（翟诗虹），."B#/ +0%309575257%(47D%95: ;0<0+#=)&((［?］/ ./,07"-,(,0=3#$（植物分类学报），%!（V）：!TA— !TV P0,5CQ（赵桂仿），Q9,(35&2Q%8D%9S0&8&==%*4%=:%9，!III/ R4D=5=48,6&5(1&::%9%(6&,6&5(5:.$,"(=0$,"5<01?#$5<（S5,3%,%）,85(L ,(,86&641&(,8L9,1&%(6 1%6%36%1 DK 9,(157 ,7=8&:&%1 =58K759=0&3 -JF［?］/ ./,0 7"-,(,0= 3#$（植物分类学报），&$（.）： #V—TI P0,(L?（张娟），P0,(L-’（张道远），’&()*（尹林克），!IIA/ C%(57&3-JF%;69,36&5( ,(1 GFS-%;=%9&7%(6 35(1&6&5(25: ;0<0+#="#&?#)0［?］/ ./,0’(,’(+%01@2//#)%$,3#$（西北植物学报），%&（!）：!MA@!M# P054P’（周泽扬），N&,X’（夏庆友），)4>（鲁成），%,01，.""B/ +0%3599%8,6&5(D%6U%%(60%(47D%95:GFS-<853&,(160% 9%8&,D&8&6K5:60%&(:597,6&5(5(L%(%6&3H,9&,6&5(&(758%348,9=0K85L%(%6&32641&%2［?］/ @%+%)#,0&（遗传），%’（M）：.!—.M P54’S（邹喻萍），$,(LNX（汪小全），)%&’-（雷一丁），%,01，.""V/ Y258,6&5(,(130,9,36%9&Z,6&5(5:656,8-JF:9572%H%9< ,8%(1,(L%9%12=%3&%2,(160%&9,88&%2［?］/ ./,0’(,3#$（植物学报），&(（T）：M!B—MAA