U NIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II __________________________________________________________ DIPARTIMENTO DI SCIENZA DEGLI ALIMENTI Tesi di Dottorato di Ricerca Scienze e tecnologie delle produzioni agro-alimentari XX ciclo Applicazione di metodi strumentali per il controllo della qualità e dell’ossidazione in alimenti lipidici Tutor Prof. Raffaele Sacchi Coordinatore Prof. Salvatore Spagna Musso Dottoranda Dott.ssa Ilaria Battimo “La scienza è sempre imperfetta. Ogni volta che risolve un problema, ne crea almeno dieci nuovi.” Georg Christoph Lichtenberg AAAAllllllllaaaa mmmmiiiiaaaa ffffaaaammmmiiiigggglllliiiiaaaa 2 INDICE PRESENTAZIONE DEL LAVORO ..................................................................................................6 CAPITOLO I. IL NASO ELETTRONICO........................................................................................9 1.1. INTRODUZIONE.............................................................................................................................9 1.1.1 Architettura del naso elettronico........................................................................................10 1.1.2 I sensori utilizzati nei nasi elettronici.................................................................................11 1.1.3 Elaborazione statistica dei dati..........................................................................................15 1.1.4 Applicazione agli alimenti..................................................................................................17 1.1.5 Conclusioni.........................................................................................................................21 1.2 MESSA A PUNTO DEL METODO DI ANALISI...................................................................................23 1.2.1. Costruzione di un pattern di riferimento per i principali difetti (rancido, avvinato e riscaldo) presenti negli oli extra vergini di oliva........................................................................26 1.2.2 Costruzione di un pattern di riferimento per l’attributo di fruttato....................................29 1.3 BIBLIOGRAFIA.............................................................................................................................34 CAPITOLO II. MESSA A PUNTO DELLE CONDIZIONI DI ANALISI DELLE SOSTANZE VOLATILI MEDIANTE HEADSPACE-SOLID PHASE MICROEXTRACTION (SPME)- GC/MS.................................................................................................................................................38 2.1 INTRODUZIONE............................................................................................................................38 2.1.1 Principio di funzionamento e ottimizzazione delle condizioni............................................39 2.1.2 Parametri che influenzano l’efficienza estrattiva della tecnica della microestrazione in fase solida....................................................................................................................................41 2.1.3 Applicazione agli alimenti..................................................................................................46 2.1.4 Confronto tra le tecniche di analisi applicate allo studio dei composti volatili dell’olio di oliva.............................................................................................................................................49 2.1.5 Conclusioni.........................................................................................................................53 2.2 MESSA A PUNTO DEL METODO DI ANALISI...................................................................................54 2.2.1 Analisi qualitativa dei composti volatili presenti negli oli di oliva....................................57 2.2.2. Analisi quantitativa dei principali composti volatili presenti negli oli di oliva................63 2.3 BIBLIOGRAFIA........................................................................................................................72 CAPITOLO III. VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ DEGLI OLI VERGINI DI OLIVA E MONITORAGGIO DELLA SHELF-LIFE.....................................................................................79 3.1 INTRODUZIONE: QUALITÀ DELL’OLIO EXTRA-VERGINE D’OLIVA................................................79 3.1.2 I componenti volatili e la qualità sensoriale dell’olio extra vergine di oliva.....................86 3.1.3 I composti chiave del flavour dell’olio extra vergine di oliva............................................88 3.1.4 Off-flavour di rancido.........................................................................................................90 3.1.5 Off-flavour fermentativi......................................................................................................90 3.1.6 L’ossidazione lipidica e la shelf-life degli oli imbottigliati................................................92 3.2. OBIETTIVI E DISEGNO SPERIMENTALE........................................................................................96 3.3. MATERIALI E METODI.................................................................................................................97 3.3.1. Campionamento.................................................................................................................97 3.3.2 Disegno Sperimentale.........................................................................................................98 3.3.3 Determinazione indice di maturazione...............................................................................99 3.3.4 Determinazione del grado di infestazione mosca olearia................................................100 3.3.5 Lavorazione materia prima..............................................................................................100 3.3.6 Determinazioni analitiche e panel test.............................................................................101 3.3.7 Determinazione dell’acidità.............................................................................................101 3.3.8 Determinazione del numero di perossidi..........................................................................102 3.3.9 Determinazione degli indici spettrofotometrici nell’ultravioletto....................................103 3.3.10 Determinazione della composizione in acidi grassi.......................................................105 3.3.11 Caratterizzazione della componente fenolica.................................................................106 3.3.12 Composizione in tocoferoli.............................................................................................107 3.3.13 Determinazione del colore.............................................................................................108 3.3.14 Analisi sensoriale...........................................................................................................108 3 3.3.15 Analisi delle sostanze volatili mediante Solid Phase Microextraction (SPME) ( vd. § 2.2) ...................................................................................................................................................109 3.3.16 Analisi delle sostanze volatili mediante naso elettronico ( vd. § 1.2).............................109 3.3.17 Analisi delle Componenti Principali..............................................................................110 3.4 RISULTATI E DISCUSSIONE.........................................................................................................111 3.4.1 Indici di qualità................................................................................................................111 3.4.2 Composizione in acidi grassi............................................................................................112 3.4.3 Valutazione della composizione fenolica e tocoferolica...................................................115 3.4.4 Pigmenti...........................................................................................................................117 3.4.5 Analisi sensoriale.............................................................................................................117 3.4.6 Analisi dei composti volatili mediante naso elettronico e mediante SPME-GC/MS........120 3.5 VALUTAZIONE DELLA SHELF-LIFE.............................................................................................125 3.5.1 Indici di qualità................................................................................................................125 3.5.2 Valutazione della composizione fenolica..........................................................................127 3.5.3 Analisi sensoriale e analisi dei composti volatili mediante naso elettronico...................131 3.5.4 Analisi dei composti volatili mediante SPME-GC/MS.....................................................134 3.5.5 Prova di shelf-life.............................................................................................................139 3.6 CONCLUSIONI............................................................................................................................149 3.7 BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................................151 CAPITOLO IV APPLICAZIONE DEL NASO ELETTRONICO AL MONITORAGGIO DEL PROCESSO DI FRITTURA............................................................................................................156 4.1. INTRODUZIONE.........................................................................................................................156 4.1.1 Tipologie di frittura..........................................................................................................158 4.1.2 Il Processo di frittura.......................................................................................................158 4.1.3 La chimica della frittura...................................................................................................159 4.1.4 Modificazioni dell’olio durante la frittura.......................................................................164 4.1.5 Caratteristiche degli oli di frittura...................................................................................165 Olio di arachide....................................................................................................................................166 Olio di palma........................................................................................................................................166 Olio di girasole.....................................................................................................................................167 Olio di oliva.........................................................................................................................................167 4.1.6 Metodi analitici per la valutazione della degradazione dell’olio sottoposto a frittura....168 4.2. OBIETTIVI E DISEGNO SPERIMENTALE......................................................................................169 4.3. MATERIALI E METODI..............................................................................................................170 4.3.1 Campionamento................................................................................................................170 4.3.2 Determinazione dell’acidità ( vd. § 3.3.7)........................................................................171 4.3.3 Determinazione degli indici spettrofotometrici ( vd. § 3.3.9)...........................................171 4.3.4 Determinazione del colore...............................................................................................171 4.3.5 Determinazione degli acidi grassi a catena corta............................................................172 4.3.6 Valutazione del flavour mediante NE (vd. § 1.2)..............................................................174 4.3.7 Determinazioni di composti polari in oli di frittura.........................................................174 4.3.8 Valutazione organolettica dell’alimento fritto.................................................................175 4.3.9 Analisi statistica (vd. § 3.3.17).........................................................................................176 4.4 RISULTATI E DISCUSSIONE.........................................................................................................177 4.4.1. Parametri qualitativi.......................................................................................................177 4.4.2 Valutazione dei Composti Polari Totali nell’olio di frittura............................................180 4.4.3 Determinazione del colore dell’olio di frittura................................................................181 4.4.4 Composizione in acidi grassi............................................................................................182 4.4.5 Valutazione del flavour che si sviluppa durante la frittura rilevato mediante Naso Elettronico.................................................................................................................................186 4.4.6 Valutazione organolettica dell’alimento fritto.................................................................188 4. 5. CONCLUSIONI..........................................................................................................................190 4. 6. BIBLIOGRAFIA.........................................................................................................................191 CAPITOLO V. VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ E DELL’OSSIDAZIONE DI ALICI SOTTO SALE DURANTE LA MATURAZIONE........................................................................194 5.1 INTRODUZIONE..........................................................................................................................194 4 5.1.1 La salagione del pesce......................................................................................................195 5.1.2 La stagionatura della alici sotto sale...............................................................................197 5.1.3 Engraulis encrasicholus (Linneo)....................................................................................198 5.1.4 La qualità nutrizionale delle alici....................................................................................200 5.1.5 I lipidi del pesce, lipolisi e ossidazione...........................................................................202 5.1.6 Tecnica di pesca e trasformazione industriale delle alici sotto sale................................205 5.1.7 Cambiamenti del flavour durante la conservazione dei prodotti ittici.............................206 5.2 OBIETTIVI DELLA RICERCA........................................................................................................209 5.3 MATERIALI E METODI........................................................................................................210 5.3.1 Campionamento................................................................................................................210 5.3.2 Disegno Sperimentale.......................................................................................................212 5.3.3 Determinazioni analitiche................................................................................................212 5.3.3.1 Estrazione dei lipidi..................................................................................................................213 5.3.3.2 Determinazione della composizione in classi lipidiche............................................................213 5.3.3.3 Analisi spettrofotometrica........................................................................................................214 5.3.3.4 Valutazione della perossidazione lipidica in campioni di pesce mediante TBA TEST............215 5.3.3.5 Analisi Sensoriale delle Alici...................................................................................................216 5.3.3.6 Valutazione del flavour mediante Naso Elettronico.................................................................217 5.3.3.7 Valutazione del flavour mediante la Microestrazione in Fase Solida accoppiata alla gas-massa (SPME-GC/MS)...................................................................................................................................217 5.4 RISULTATI E DISCUSSIONE...............................................................................................222 5.4.1 Analisi quantitativa dei lipidi totali..................................................................................222 5.4.2 Composizione delle classi lipidiche e sua evoluzione durante la maturazione................224 5.4.3 Indici di osidazione..........................................................................................................228 5.4.4 Valutazione mediante Naso Elettronico del flavour che si sviluppa durante la maturazione delle alici sotto sale...................................................................................................................231 5.4.5 Qualità sensoriale............................................................................................................233 5.4.6 Analisi dei composti volatili mediante SPME-GC/MS.....................................................234 5.5 CONCLUSIONI............................................................................................................................239 5.6 BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................................240 5 Presentazione del lavoro Presentazione del lavoro Negli ultimi anni l’accresciuta consapevolezza del consumatore nei riguardi della qualità degli alimenti ha creato aspettative sempre maggiori per alimenti caratterizzati da elevati standard di qualità e sicurezza. La qualità di un alimento, rappresenta l’insieme delle caratteristiche di un prodotto in grado di soddisfare le esigenze espresse e implicite (ISO 9000). La valutazione sensoriale di un prodotto alimentare, in termini di aspetto fisico, odore, colore e sapore contiene nel suo complesso moltissime informazioni. In particolare l’aroma di un alimento, dovuto alla presenza di molte sostanze chimiche volatili, conferisce caratteristiche e qualità uniche, e quindi rappresenta un parametro sensoriale di estremo interesse. La possibilità di misurare e identificare l’aroma e le caratteristiche di sapori persistenti di un prodotto permette di ottenere una molteplicità di informazioni direttamente correlate alla accettabilità ed alle caratteristiche nutrizionali e qualitative in termini di salubrità e sicurezza del prodotto. Questo ha comportato una crescente necessità e interesse verso sistemi di monitoraggio non distruttivi a elevata versatilità, sensibilità, accuratezza, economicità d’esercizio, semplicità d’impiego e soprattutto rapidità di risposta analitica. Uno di questi è il cosiddetto “naso elettronico”. La ricerca in questo campo, negli ultimi anni, ha permesso la realizzazione di sensori sempre più affidabili e stabili nel tempo, permettendo la realizzazione di sistemi olfattivi artificiali utilizzabili non solo in laboratorio ma anche direttamente sugli impianti di produzione per il monitoraggio in continuo degli odori in modo da rendere oggettive le misure così ottenute. Tale strumento, caratterizzato da un insieme di sensori aspecifici, offre una misura globale dell’odore di un prodotto, operando in maniera simile all’olfatto umano, non essendo in grado di identificare le singole molecole. Per questo motivo, nonostante tali strumenti rappresentino il futuro tecnologico per le analisi di routine, restano di grande importanza le tecniche strumentali che consentono di caratterizzare in maniera specifica i composti che caratterizzano il flavour degli alimenti. Tra le tecniche di concentrazione/estrazione della frazione volatile di alimenti lipidici negli ultimi anni è stata introdotta, in alternativa alla tecnica del purge and trap per il Presentazione del lavoro pre-arricchimento del campione prima dell’analisi cromatografica, la Microestrazione in Fase Solida dello spazio di testa statico (HS-SPME), sviluppata nei primi anni ’90 da Arthur e Pawliszyn per studiare gli inquinanti nelle acque ed estesa, in seguito, all’analisi del flavour degli alimenti. La tecnica prevede una prima fase di concentrazione/estrazione dei componenti volatili mediante l’esposizione allo spazio di testa di una fibra in silice fusa rivestita da un film relativamente sottile di fase stazionaria polimerica. Durante questa fase si stabilisce un equilibrio tra le concentrazioni degli analiti presenti nello spazio di testa del campione e il rivestimento polimerico della fibra. Dopo un opportuno tempo di estrazione, la fibra viene ritirata nell’ago e rimossa dalla vial contenente il campione per essere inserita direttamente nell’iniettore del GC per la successiva fase di desorbimento. L’SPME presenta numerosi vantaggi come la semplicità, la rapidità, l’eliminazione di solventi, l’alta sensibilità, l’utilizzo di piccole quantità di campione e il basso costo. Questo lavoro di tesi ha avuto perciò come obiettivo la valutazione del possibile impiego del Naso Elettronico e della MicroEstrazione in Fase Solida accoppiata alla GC/MS nel controllo di qualità e dell’ossidazione in alimenti lipidici. In particolare, il capitolo I è stato dedicato allo studio del Naso Elettronico, al suo funzionamento e alla messa a punto della metodica di analisi applicata al controllo di qualità degli oli di oliva. Per l’applicazione del naso elettronico all’analisi degli oli è stato necessario creare una banca dati, analizzando campioni di riferimento per creare la memoria dello strumento. L’attività di ricerca discussa nel capitolo II ha riguardato il funzionamento dell’analisi SPME-GC/MS e la messa a punto della metodica di analisi. Per ottenere oltre all’analisi qualitativa anche un’analisi quantitativa, è stato necessario analizzare una serie di composti standard a diverse concentrazioni in modo da ottenere delle rette di taratura di riferimento. Nel capitolo III viene riportata l’applicazione del NE e della SPME-GC/MS nel controllo di qualità degli oli vergini di oliva. L’attuale normativa europea prevede che un olio per essere commercializzato con la definizione di “vergine extra” debba presentare oltre a valori degli indici analitici nei limiti prefissati, l’assenza di qualsiasi difetto organolettico (off-flavour). L’unico metodo previsto dal regolamento comunitario per la rilevazione degli off-flavour è l’analisi sensoriale (panel-test) 7 Presentazione del lavoro svolta secondo la metodologia sviluppata dal Consiglio Oleicolo Internazionale (COI). Quindi è di grande interesse l’utilizzo di strumentazioni analitico-sensoriali in grado di valutare in maniera oggettiva oli diversi, semplicemente in base alla percezione dell’aroma senza bisogno di effettuare nessun tipo di analisi chimica o pretrattamento del campione. Per questo motivo, in questa parte del lavoro sperimentale è stata anche effettuata una prova di shelf-life con oli raccolti nella campagna olearia 2004-2005 e provenienti dalla penisola Sorrentina, con l’obiettivo di valutare il contributo di suddette metodiche nel discriminare sia diversi aromi che caratterizzano gli oli extravergini che i principali difetti (off-flavour), ed in particolare la rancidità. L’attività di ricerca discussa nel capitolo IV ha riguardato il processo di frittura. Tale processo di cottura, soprattutto quando viene applicato nei trattamenti industriali degli alimenti, modifica le proprietà organolettiche e nutrizionali dei cibi. Infatti il grasso o l’olio usato come mezzo di trasferimento del calore è esposto per lunghi periodi ad alte temperature a contatto con gli alimenti, che risultano quindi modificati nella composizione chimica e nelle proprietà fisiche. Durante il riscaldamento prolungato, l’olio subisce molte reazioni, che possono essere classificate come reazioni di idrolisi, ossidazione e polimerizzazione (White, 1991). Molti fattori, come la natura del grasso usato come mezzo di frittura, la temperatura del processo, il turn over dell’olio e la composizione degli alimenti, influenzano i cambiamenti chimico- fisici che si manifestano durante la frittura. Una rapida valutazione della degradazione degli oli durante il processo di termo-ossidazione potrebbe essere quindi estremamente vantaggiosa. Il naso elettronico potrebbe dare un utile contributo in tal senso. Questa parte del lavoro di tesi di dottorato ha avuto lo scopo quindi di utilizzare il naso elettronico per monitorare la degradazione degli oli durante il processo di frittura, e di confrontare i risultati ottenuti con quelli derivanti dalle analisi convenzionali. Infine, il capitolo V ha riguardato l’applicazione del naso elettronico e della microestrazione in fase solida accoppiata alla gas massa all’analisi di prodotti ittici e in particolare al monitoraggio del flavour e dell’ossidazione lipidica durante il processo di maturazione delle alici sotto sale. 8 Capitolo I Il Naso Elettronico Capitolo I. IL NASO ELETTRONICO 1.1. Introduzione L’odore di una sostanza è una caratteristica che permette la sua identificazione soggettiva mediante il senso dell’olfatto, quindi la condizione fondamentale per la percezione è che l’odore deve essere annusato, cioè le sostanze odorose devono trovarsi allo stato di vapore per essere inalate attraverso le narici, giungere nella parte superiore della cavità nasale e entrare in contatto con i recettori olfattivi. Per la valutazione dell’odore si ricorre all’analisi sensoriale mediante “panel test” cioè all’elaborazione dei risultati di una prova di assaggio olfattivo effettuato da un gruppo (panel) di persone addestrate, le quali provvedono a descrivere le sensazioni olfattive e a dare un voto all’odore del prodotto in esame, quando richiesto. Nel caso dei prodotti alimentari, l’analisi dell’odore è condotta insieme a quella gustativa per la valutazione dell’aroma o flavour del prodotto, data la complementarietà dei due sensi, strettamente collegati tra loro (Polesello, 1999). In risposta alla crescente richiesta di analisi sensoriali oggettive per controllare la qualità dei prodotti alimentari, la ricerca ha imboccato strade che solo pochi anni fa non erano immaginabili. Perciò, non sorprende che negli ultimi anni siano stati fatti numerosi sforzi per introdurre strumenti di misura che funzionano in maniera simile all’olfatto umano, ma che abbiano l’oggettività di uno strumento. Il concetto di “sistema olfattivo artificiale” formato da una serie di sensori, è stato proposto nel 1982 da Persand and Dodd. Ma solo agli inizi degli anni 90 comparvero i primi strumenti disponibili sul mercato. Gardner and Barlett hanno proposto una definizione di “naso elettronico”, secondo la quale “un naso elettronico è uno strumento che comprende una serie di sensori chimici non specifici e un appropriato sistema di trattamento dei dati, in grado di caratterizzare e riconoscere odori semplici e complessi” che viene attualmente utilizzata (Gardner et al., 1994). Capitolo I…………………………………………………………..Il Naso Elettronico 1.1.1 Architettura del naso elettronico Un naso elettronico è costituito da tre componenti principali (Gardner et al., 1994, 1999; Nagle et al., 1998): - sistema di rilevazione dei gas; - sistema di elaborazione dei segnali provenienti dai sensori; - sistema di identificazione/riconoscimento degli odori; Questi tre componenti con differenti funzionalità sono connessi in cascata. In un tipico naso elettronico il sistema di rilevazione dei gas è composto da un sistema di campionamento chimico e da una matrice di sensori, normalmente caratterizzata da una scarsa selettività, cioè sensibili ad una vasta gamma di composti chimici. La matrice dei sensori è costituita da un insieme di elementi con caratteristiche diverse, in modo che l’insieme delle loro risposte rappresenti un pattern caratteristico per ciascuna miscela chimica. In genere, la matrice di sensori è alloggiata in una camera di misura realizzata con un materiale chimicamente inerte (PVC, vetro o acciaio inossidabile), in cui fluisce un gas di riferimento (per esempio aria sintetica o azoto). Il gas di riferimento viene utilizzato per stabilire la linea di base per la risposta dei sensori. Per effettuare la misura vera e propria il sistema di campionamento chimico provvede a iniettare, in condizioni controllate, l’odorante nella camera di misura, producendo una variazione quasi istantanea dell’atmosfera chimica e, dunque, una risposta transitoria dei sensori. La condizione di regime viene raggiunta in un tempo che varia da pochi secondi fino ad alcuni minuti, a seconda della tipologia dei sensori, delle condizioni operative e dell’odorante sotto esame. La misura si conclude iniettando nuovamente nella camera il gas di riferimento, ripulendo, così, il materiale attivo che costituisce i sensori e riportando la loro risposta alla linea di base. Il sistema di elaborazione provvede, dapprima, alla pre-elaborazione delle risposte dei sensori, che consiste nella riduzione delle derive, attraverso opportune tecniche di compensazione, e nella normalizzazione dei dati. Successivamente, esegue la compressione dell’informazione attraverso l’estrazione di alcuni parametri caratteristici (feature extraction) e l’eliminazione delle informazioni ridondanti (Fort et al., 2003). 10