Schnellmethoden der Kern- nnd Chromosomen untersuchung Von Prof. Dr. Lothar Geitler Wi en Mit 13 Textabbildungen Dr itt e, umgearbeitete und erweiterte Auflage Wien Springer-Verlag 1949 ISBN-13: 978-3-211-80089-8 e-ISBN-13: 978-3-7091-5056-6 DOl: 10.1007/978-3-7091-5056-6 Alle Rechte, insbesondere das der Ubersetzung in fremde Sprachen,vorbehalten. Copyright 1942 by Gebriider Borntraeger in Berlin-Zehlendorf, and 1949 by Springer-Verlag in Vienna. Softcover reprint of the hardcover 3rd edition 1949 Aus dem Vo rwort zur ersten Auflage Dank ihrer engen Verknupfung mit der Vererbungslehre und zuchte rischen Praxis wie auch mit anderen biologischen Teilgebieten kommt der Chromosomenforschung uber den engeren Kreis der auf diesem Gebiet tatigen Forscher hinaus allgemeineres Interesse zu. Es ist daher begreif lich, daB auch auf anderen Gebieten arbeitende Forscher und biologisch interessierte Laien den Wunsch besitzen, sich mit Chromosomenunter suchungen zu beschaftigen. Dem steht oft der Umstand hinderlich ent gegen, daB eine kurze und umfassende technische Anleitung fehlt. Viel fach findet man auch die Vorstellung, daB fur derartige Untersuchungen die Beherrschung zahlreicher komplizierter und zeitraubender Methoden und vielerlei Behelfe notig sind. Auch die ublichen technischen Leitfaden enthalten eine Unzahl von Angaben uber Fixierung, Farbung u. a. m.; dies sind Uberbleibsel aus vergangenen Tagen. Die moderne Kern forschung strebt im Gegenteil dahin, mit wenigen Universalmethoden aus zukommen, deren Wirkung klar definiert ist. Der Wert der neuen Methoden liegt, abgesehen von der Ermoglichung einer einwandfreien Kernuntersuchung uberhaupt, darin, daB sie sehr wenig zeitraubend sind; viele Ergebnisse der letzten Jahre konnten allein dank der Schnelligkeit der Methoden, also der Untersuchungsmoglichkeit eines sehr groBen Materials gewonnen werden. Dies ist auch von didak tischer Bedeutung, da der Anfanger dadurch in die Lage versetzt wird, in kurzer Zeit verschiedene Objekte zu untersuchen und sich die notigc Kritik anzueignen. Die im folgenden gegebene Anleitung ist in dieser Hinsicht erschopfend, d. h. sie ermoglicht es, brauchbare Kernuntersuchungen an beliebigen niederen oder hoheren Pflanzen und Tieren durchzufiihren; fur an d ere cytologische Problemstellungen rein histologischer und organographischer Natur sind die Methoden allerdings nur beschrankt verwendbar, und es muB dann oft auf die gewohnte Mikrotomtechnik zuriickgegriffen werden. Urn eine moglichste Kurze der Darstellung zu erreichen, wird die Handhabung des Mikroskops, die Zeichentechnik und anderes, was zum gewohnlichen Rustzeug gehort, als bekannt vorausgesetzt; nur an ein zelnen Stellen schienen Hinweise in dieser Richtung angezeigt. Ebenso IV Vorwort zur dritten Auflage. konnte auf die theoretischen Grundlagen del' Kern- und Chromosomen forschung nicht eingegangen werden. Ferner blieben historische Schilde rungen und Literaturnachweise im allgemeinen weg; an diesel' Stelle sci hervorgehoben, daB die Schnellmethodik besonders von BELAR, BELLING, DE MEIJERE, DARLINGTON, HEITZ, SCHNEIDER u. a. begriindet und aus gebaut wurde. Es ist im iibrigen selbstverstandiich, daB nicht samtliche jemals be schriebenen Modifikationen und Anwendungsmoglichkeiten del' Methoden geschildert werden konnen; es solI vielmehr nul' ein Grundstock von praktischen Kenntnissen vermittelt werden, den dann jeder einzelne nach seinen Zielen und Neigungen ausbauen kann. Wien, im Dezcmber 1939. Vo rwort zur dritten Auflage Die vorliegende Auflage wurde um den neuen Abschnitt del' Hinweise auf be sanders geeignete Objekte erweitert, es wurden einige Zusatze ein gefiigt und die Zahl del' Abbildungen wurde von 8 auf 13 erhoht. Von del' Schilderung einiger neuer Modifikationen del' Methodik wurde Ab stand genommen, da sie unwesentlich und entbehrlich sind. Dem Herrn Verleger sei fUr seine umsichtige Wirksamkeit herzlich gedankt! Wien, 1m Juli 1949. Inhaltsverzeichnis Seite V orwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. III Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1. Die Karminessigverfahren............................... 2 1. Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2. Herstellung von Karminessigsaure und Alkohol-Eisessig . . . . . 2 3. Richtlinien fUr die Praparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4. Anwendung von KE. allein............................... 4 5. Untersuchung der Speicheldriisenchromosomen der Dipteren- larven ... .. ... ... .......................... ........... .. 6 6. Anwendung von KE. in Verbindung mit AE............... 8 a) Ausstriche ........................................... 8 b) Untersuchung der friihen Stadien der Pollenreifung...... 10 c) HEITzsche Kochmethode fiir Gewebe .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 d) Anwendung in anderen Fallen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 7. Untersuchung von aufbewahrtem Material.. . . . . . . . . . . . . . . . 12 8. Dauerpraparate.......................................... 13 9. Vorteile und Grenzen der KE.-Verfahren ..... ............. 16 10. Spiralbau der Chromosomen.............................. 18 II. Die Osmiumtetroxydverfahren .......................... 20 1. Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20 2. Vorbehandlung mit Os04-Dampfen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 21 3. Fixierung................................................ 22 4. Farbung................................................. 22 a) Vorbereitung .......................................... 22 b) Safranin-Lichtgriin..................................... 23 Herstellung ........................................... 23 Anwendung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 24 Einbettung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 24 c) Gentianaviolett nach GRAM............................. 25 d) Modifikation der Gentianaviolett-Farbung................ 26 5. Vorteile und Grenzen der Osmiumtetroxydverfahren ......... 26 III. Die Nuklealquetschmethode nach HEITZ................ 27 IV. Untersuchungsobjekte ................................... 28 1. Vorbemerkungen ......................................... 28 2. Hohere Tiere. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29 a) Mitose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29 b) .Meiose................ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29 3. Hohere Pflanzen ......................................... 30 a) Mitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 30 b) Meiose.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 31 4. Protisten .............. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 31 Anhang: Lebenduntersuchung ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 32 BeschluB ....................................................... 35 Einleitung Grundsatzlich lassen sich Kerne und Chromosomen sowohl im Leben wie nach Fixierung und Farbunguntersuchen. Die Lebenduntersuchung ist allerdings nur unter giinstigen, durch das Objekt gegebenen Voraus setzungen moglich und auch dann nur bei Verfolgung besonderer Ab sichten sinnvoll, da fixierte und gefarbte Kerne und Chromosomen sich im allgemeinen besser untersuchen lassen. Die Veranderungen, welche Kerne und Chromosomen bei der Fixierung erleiden, sind heutzutage hinlanglich bekannt, so daB sie als Fehlerquellen bei der Untersuchung kaum mehr in Frage kommen. Der Vergleich von lebendem mit richtig fixiertem Material hat zudem ergeben, daB die sogenannten "Fixierungs arlefakte" sehr geringfiigig sind (Abb. 1). Wo dennoch Zweifel bestehen (z. B. bei der Beurteilung von Ruhekernstrukturen), kann wohl immer an irgendeinem Teil des Tieres oder der Pflanze zum Vergleich eine Lebenduntersuchung vorgenommen werden. Es ist dabei aber darauf zu achten, daB die untersuchten Zellen wirklich leben und nicht geschadigt sind; man untersuche also unter allen VorsichtsmaBregeln (besonders vermeide man Druck!) in der korpereigenen Fliissigkeit, in isotonischem oder indifferentem (z. B. Paraffinol) Medium und verwende als Kriterium fiir die Lebendigkeit Plasmastromung, ablaufende Mitose usw. (vgl. den Anhang). Ein unter allen Umstanden gleich gut wirkendes Fixierungsmittel gibt es nicht. Auch sogenannte "gute" Fixierungsmittel wirken nur dann richtig, wenn sie in die lebenden Zellen plOtzlich, also unverdiinnt, eindringen konnen; sie versagen also im Innern dicker Gewebe und an einzelnen Zellen dann, wenn diese von undurchlassigen Membranen umgeben sind. Deshalb nimmt man z. B. die Untersuchung der Meiose bei hoheren Pflanzen und Tieren nicht wie friiher an ganzen oder zer stiickelten Antheren bzw. Roden vor, die dann mit dem Mikrotom geschnitten werden, sondern fertigt Ausstriche des Antheren- hzw. Rodeninhalts an und fixiert die isolierten Pollenmutterzellen oder Spermatocyten. Die Vorteile dieser und ahnlicher Arbeitsweisen bestehen 1. in der tadellosen Fixierung, 2. in der Beobachtung unverletzter Zellen Geitler, Schnellmethoden, 3. Auf!. 1 2 Die Karminessigverfahren bzw. Kerne und Teilungsfiguren, 3. in einer sehr groBen Zeitersparnis. Bei der Untersuchung von somatischen Geweben ist eine vitale Zer legung in Einzelzellen nicht maglich, aber bei Verwendung bestimmter Fixierungsmittel und entsprechender nachheriger Behandlung auch nicht natig; unter Umgehung der Mikrotomtechnik gelingt es auch in diesen Fallen unverletzte und besser als sonst fixierte Kerne in kurzer Zeit zur Untersuchung zur Verfiigung zu haben. AIle Schnellmethoden beruhen grundsatzlich auf einem der beiden angedeuteten Arbeitsgange. Nach der Beschaffenheit der zur Verwendung kommenden Fixierungsmittel und Farbstoffe lassen sie sich zweckmaBig wie folgt in drei Gruppen zusammenfassen. I. Die Karminessigverfahren 1. Allgemeines In Essigsaure geWstes Karmin farbt intensiv das Chromatin der Ruhekerne und die Chromosomen. Da Essigsaure fixierend wirkt, kann die Lasung - im folgenden kurz KE. genannt - gleichzeitig zur Fixierung und Farbung verwendet werden. Allerdings ist diese Fixierungswirkung oft ungeniigend, so daB mit einem geeigneten Mittel vorfixiert werden muB. Als solches kommt allein ein Gemisch von Alkohol und Essig saure (AE.) in Betracht. Da Essigsaure auf Chromosomen, Spindel, Plasma usw. leicht quellend wirkt, erscheinen die Strukturen etwas graBer und lockerer als im Leben und nach sonstiger Behandlung. Die Essigsaure bewirkt ferner eine Mazeration der Gewebe, so daB sich die Zellen leicht aus dem Gewebe verb and lOsen lassen. Ein besonderer Vorteil liegt darin, daB KE. die Nukleolen nicht farbt, wodurch Verwechslungen mit Chromatin aus geschlossen werden (Protisten, "Chromatinnukleolen" !). Durch aIle seine Eigenschaften ist das KE.-Verfahren zu einem unentbehrlichen Behelf geworden; mit seiner Hilfe gelingt es, von einem beliebigen Orga nismus innerhalb weniger Minuten ein Bild seiner Karyologie zu erhalten. 2. Herstellung von KarminessigsRure und Alkohol-Eisessig KE. Man mischt 45 Raumteile konzentrierter Essigsaure (Eisessig) mit 55 Raumteilen dest. Wasser, gibt im UberschuB (etwa 1 g auf 100 ccm 45%ige Essigsaure) gutes Karmin, z. B. Carminum rubrum optimum von GRUBLER, bei und laBt iiber einer kleinen Flamme etwa 1/2 bis 1 Stunde lang ganz schwach kochen; steht kein RiickfluBkiihler zur Vermeidung von· Destillationsverlusten zur Verfiigung, so kocheman in einem Erlen meyerkolben mit engem Hals. Nach voIligem Abkiihlen filtriert man die gesattigte, dunkelrote Lasung in eine Vorratsflasche, von der aus sie zum handlichen Gebrauch in ein Stiftflaschchen abgefiiIlt werden Richtlinien fur die Priiparation 3 kann. Das uberschussige Karmin kann nach Trocknung wieder verwendet werden. Bei langem Stehen der Losung etwa ausfallendes Karmin ist weg zufiltrieren. 1m ubrigen ist KE., wenn sie gut verschlossen aufbe wahrt wird, unbegrenzt haltbar. AE. Man mischt drei Raum teile absoluten Alkohol mit einem Raumteil konzentrierter Essig saure. Die Mischung mu13 stets unmittelbar vor Gebrauch er folgen, da beim Stehenlassen Zersetzung eintritt. An Stelle von absolutem kann ohne merkbaren Nachteil auch 96- bis 98%iger Alkohol verwendet werden. Bei manchen Flagellaten und Ciliaten empfiehlt sich ein Mischungs 2 verhaltnis von 4: 1 oder 5: 1. 3. Richtlinien fUr die Priiparation Essigsauredampfe rufen in den zu fixierenden Objekten Artefakte hervor; man bringe also die Ob jekte plotzlich in AE. oder KE. oder ubergie13e sie. Sollen Gewebe .- untersucht werden, so fixiere man ., 3 moglichst kleine StUcke; vor aHem befreie man sie von schwer durch lassigen Hullen, z. B. Vegetations • punkte von den alteren Blattern, Wurzelspitzen schneide man die Wurzelhaube ab, gro13ere Wurzel spitzen durchschneide man auch Abb. 1. Ausstrich aus einem Hoden von 8tenobothru8 lineatu8 (Peldheuschrecke); der Lange nacho Objekte, die in man sieht drei Spermatocyten im Sta Wasser liegen (Algen, kleine Tie dium des Diplotans. 1 lebend, 2 nach re) sind moglichst vom Wasser zu Raucherung mit Os04-Dampf und Fixie befreien (durfen aber naturlich rung mit FLEIIIIIIINGS Gemisch, 3 nach Einschluf3 in Kanadabalsam. Photo, nicht austrocknen). Zusatz von gleiche Vergr. (680fach); nach BELAR. Wasser ist uberhaupt wahrend des ganzen Arbeitsganges zu vermeiden; trocknet die KE. wahrend der Beob achtung aus, so ist nicht Wasser, sondern ein Tropfen KE. vom Deckglas rand her zuzusetzen. - Gewohnliche Pinzetten und Prapariernadeln geben 1* 4 Die Karminessigverfahren Eisen an die LOsung ab; will man dies vermeiden, so verwende man solche aus nichtrostendem Werkstoff; andererseits ist bei schnellem Arbeiten die Eisenabgabe geringfiigig und nicht hinderlich, oft sogar erwiinscht, indem sich Eisenkarmin bildet, das statt der rein roten eine violette bis schwarze, kontrastreiche Farbung hervorrnft.l - Fiir feinste Unter suchungen empfiehlt es sich, ein dichtes Griinfilter zu verwenden (mono chromatisches Licht I), wobei die rote Farbung schwarz erscheint; die Lichtquelle muB dann entsprechend stark sein. Da die Praparate oft dicker als Mikrotomschnitte sind und in der Regel mit Immersion unter sucht werden, sind "extra diinne" , sogenannte C-Deckglaser, zu ver wenden; fiir die in Betracht kommenden Ausstriche, Quetsch- und Zupf praparate eignet sich am besten das Normalformat (18 X 18 mm). Bei Untersuchung in KE. ist infolge der eigentiimlichen Lichtbrechungs verhaltnisse der Blendenoffnung und Kondensorstellung besonderes Augenmerk zuzuwenden I 4. Anwendung von KE. allein Allein angewandte KE. fixiert nur dann gut, wenn sie augenblicklich in die Zellen eindringt; sie kommt also zunachst nur fiir frei liegende unbehautete oder mit durchlassiger Membran versehene Zellen in Betracht. Doch ist auch dann die Farbung oft nicht intensiv genug und gefarbte Zelleinschliisse (Chromatophoren) konnen storen. Die Anwendung ist also beschrankt, liefert aber in besonderen Fallen bessere Ergebnisse als nach AE.-Fixierung. Man mache es sich zum Grundsatz, im Einzel fall verschiedene Modifikationen der KE.-Methoden auszuprobenl Fast immer laBt sich KE. allein zum Zweck einer schnellen und einfachen Orientierung verwenden, wenn also z. B. festgestellt werden solI, ob und in welchen Bliitenknospen die Meiose ablauft, wieweit die Entwicklung der Roden in Larven von Insekten fortgeschritten ist u. dgl. mehr. In solchen Fallen zerzupft man das lebende Material mittels Nadeln in einem Tropfen KE. auf dem Objekttrager, legt nach Ent fernung etwa zu groBer Teile (z. B. der Antherenwande) das Deckglas auf (das immer moglichst dicht anliegen solI), und kann mit der Unter suchung beginnen. Kleine Algen und Tiere lassen sich natiirlich ohne Zerzupfen untersuchen (Abb. 2). Oft ist dabei leichte und kurze Er warmung (nicht Kochenl) vorteilhaft, da dabei die Chromatinfarbung intensiver wird, ohne daB sich das Plasma anfarbt; bei zu starker Er warmung quellen die Chromosomen unter Vakuolisierung auf (Abb. 9b). Vielfach leisten auch Randschnitte des lebenden Materials, die man einfach in KE. legt und mit dem Deckglas bedeckt, gute Dienste. So Manche Untersucher setzen deshalb von vornherein der KE. in Spuren 1 Eisensalze zu (z. B. Eisenalaun, Eisenchlorid). Anwendung von KE. allein 5 kann man Querschnitte durch Wurzeln, Blatter, Hymenien von Hut pilzen u. a. m. leicht und schnell untersuchen und sich uber das Aussehen der Keme, den Ablauf von Teilungen usw. unterrichten. In bestimmten Fallen ist die Behandlung mit KE. allein auch fur die endgultige Untersuchung anderen Methoden vorzuziehen. Dies gilt z. B. oft fUr die Untersuchung des Ablaufs der Meiose in den Pollen mutterzellen (Abb. 3) und der 1. Pollenkommitose.1 Man geht dabei so .., Abb. 2. Zweikernige Zellen der Grunalge Rhizoclonium, oben die Kerne in Metaphase (rechts Flachenbild, links Seitenansicht), unten die Kerne in Ana phase (die rechte Spindel steht geneigt zur Bildebene, daher die eine Tochter· platte unscharf). - KE., Venezianischer Terpentin; Photo, etwa IOOOfach. vor, daB man eine Anthere auf dem Objekttrager mit einem scharlen Messer (Rasiermesser oder Rasierklinge) durchschneidet und den hervor quellenden schleimigen Inhalt sofort mit einem Tropfen KE. bedeckt; Eindickung oder gar Eintrocknung ist unbedingt zu vermeiden. Bei derberen Antheren kann der Inhalt auch ausgedriickt werden, wobei allerdings oft noch vor der Fixierung Artefakte entstehen konnen. 1m allgemeinen wird man beobachten, daB die Pollenmutterzellen oder Pollenkorner eines Praparates verschieden gut fixiert und gefarbt sind: an Stellen dichterer Zellansammlungen ist die KE. verdiinnt eingedrungen, Die erste Pollenkornmitose ist fast immer zur Zahlung der Chromosomen 1 und zum Studium ihrer Morphologie besonders geeignet, da die Chromosomen in haploider Zahl vorhanden sind, ihre Anordnung locker ist und gute Fixierung leicht gelingt (Abb. 4).