Rôle des facteurs de transcription NOR1 et TLE1 dans les macrophages alternatifs humains Federica de Paoli To cite this version: Federica de Paoli. Rôle des facteurs de transcription NOR1 et TLE1 dans les macrophages alternatifs humains. Médecinehumaineetpathologie. UniversitéduDroitetdelaSanté-LilleII,2015. Français. ￿NNT: 2015LIL2S006￿. ￿tel-01257811￿ HAL Id: tel-01257811 https://theses.hal.science/tel-01257811 Submitted on 18 Jan 2016 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. UNIVERSITE LILLE NORD DE FRANCE FACULTE DE SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES Thèse Pour obtenir le grade de : DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LILLE 2 Spécialité : Biochimie et Biologie Moléculaire Rôle des facteurs de transcription NOR1 et TLE1 dans les macrophages alternatifs humains Presentée et soutenue publiquement par : Federica DE PAOLI Le 25 Février 2015 Directrice de thèse: Dr Giulia CHINETTI-GBAGUIDI Jury: Pr. Bart STAELS, Président Dr. Laurent YVAN-CHARVET, Rapporteur Pr. David MASSON, Rapporteur Dr. Philippe LEFEBVRE, Examinateur Tout est une question d’équilibre REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur le Professeur Bart Staels, qui m’a accueillie au sein de son laboratoire et me fait l’honneur de présider le jury de cette soutenance de thèse. Je l’en remercie sincèrement. Je souhaite adresser ma plus profonde gratitude à ma directrice de thèse Madame le Docteur Giulia Chinetti-Gbaguidi. Je vous remercie pour la confiance que vous m’avez accordée depuis le premier instant. Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance pour votre rigueur scientifique, vos précieux conseils, votre soutien et infinie disponibilité ainsi que pour votre présence constante qui n’a jamais cessée malgré les changements logistiques intervenus dans les derniers temps. Je vous serai toujours reconnaissante pour l’énorme bagage scientifique que vous m’avez transmis. E’ stato un onore lavorare con lei e non potrò mai ringraziarla a sufficienza per quanto ho imparato al suo fianco in questi anni. Messieurs le Docteur Laurent Yvan-Charvet et le Professeur David Masson, vous me faites l’honneur d’avoir accepté de juger ce travail et d’en être les rapporteurs. Je vous prie de trouver ici le témoignage de ma reconnaissance et mon profond respect. Monsieur le Docteur Philippe Lefebvre, je suis honorée de votre présence dans mon jury de thèse en qualité d’examinateur. Recevez ici mes sincères remerciements. Je remercie Jérôme pour sa disponibilité et son professionnalisme, j’ai apprecié travailler avec toi au cours des ces années. Je tiens à exprimer un immense merci à tous les gens du labo, de Pasteur à J&K pour leur sympathie. Une mention spéciale à Christian pour les tonnes de gel shift et de plasmides clonés, les bons conseils, les petites blagues et pour m’avoir aidée à relativiser les choses :-), Corinne C pour ta rigueur en salle de culture, Bruno pour les milliards de Q-PCR, à Sophie et Yasmine, correctrices officielles de la forme de ce manuscrit, à Mehdi, mon collègue « fou » de bureau, à Benoit, Jonathan, Steve, Denis, Gael, Stephane, Corinne R, Isa et Barbara pour vos suggestions, vos sourires et votre soutien. Je l’ai beaucoup apprécié ! 3 Un super grand merci (GRAZIE) à Mél ( !!), Loïc et Geoffrey pour vos blagues, le grand aide et pour avoir fait preuve de courage à tolérer mon sacré caractère, heureusement que « par fois » vous étiez la:-P Un immense merci à ceux que j’ai croisé dans les couloirs de ce labo et que avec le temps sont devenus mes amis dans cette vie française : Yoanna, Vera, Morgane et Michal. LN, merci pour nos entraînements sportifs, divisés entre la course à pied dans les soirées glaciales d’hiver et les bains dans l’eau chlorée des piscines lilloises pour déteindre les nerves. Manju, it was a big chance to meet you! Thanks a lot for having initiated me to indian food, by the way I still prefer when you add sugar instead of spicies :-P Merci à Marta et Clement pour avoir rendu les années lillloises amusantes, riches en rencontre et folles à la juste mésure. Un grazie di cuore alla mia famiglia per non avermi mai fatto mancare supporto e calore in questi anni lontana da casa. Grazie grazie grazie ai miei amici di sempre che nonostante le “interruzioni di segnale” di skype e whatsap mi sono sempre stati vicini, mi hanno motivata, compresa e regalato una risata: Manu, Sara-Clara, Davide, Roby, Melissa, Anita, Claudia, Fiocco. Comment oublier Sami et Vale, parce que nous sommes « tous dans le même bateau ». Sami merci pour m’avoir accompagnée dans mes délires comme le saut à l’élastique ! La prochaine épreuve : saut en parachute ! Vale cosa fare io senza di te ? Sei la miglior compagna di avventura ed Amica che avrei mai potuto desiderare!! Grazie di cuore per tutto :-) 4 LISTE DES PUBLICATIONS Publications originales De Paoli F, Eeckhoute J, Copin C, Vanhoutte J, Duhem C, Derudas B, Dubois-Chevalier J, Colin S, Zawadzki C, Jude B, Haulon S, Lefebvre P, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. The neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1) is induced upon human alternative macrophage polarization and stimulates the expression of markers of the M2 phenotype. Atherosclerosis 2015 (en revision favorable). Vinod M, Chennamsetty I, Colin S, Belloy L, De Paoli F, Schaider H, Graier WF, Frank S, Kratky D, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G, Kostner GM. miR-206 controls LXRα expression and promotes LXR-mediated cholesterol efflux in macrophages. Biochim Biophys Acta 2014; 1841(6): 827-35. Article de synthèse De Paoli F, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. Macrophage phenotypes and their modulation in atherosclerosis. Circulation Journal 2014; 78(8):1775-81. COMMUNICATIONS ORALES ET AFFICHEES De Paoli F, Eeckhoute J, Copin C, Vanhoutte J, Derudas B, Chevalier J, Zawadzki C, Jude B, Haulon S, Pattou F, Lefebvre P, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. The Neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1) is induced upon human alternative macrophage polarization and stimulates markers of the M2 phenotype. 10ème congrès de la NSFA (Nouvelle Société Française d’Athérosclérose), Biarritz , 19-21 juin 2014. Communication affichée, obtention du prix poster. De Paoli F, Eeckhoute J, Copin C, Vanhoutte J, Derudas B, Chevalier J, Zawadzki C, Jude B, Haulon S, Pattou F, Lefebvre P, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. Control of macrophage polarization by NOR1. Journée Think Tank 2014, Lille, 26 juin 2014. Communication orale De Paoli F, Copin C, Vanhoutte J, Zawadzki C, Jude B, Haulon S, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. The neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (NOR1) is induced in human alternative macrophages and controls the expression of alternative polarization markers. 81ème congrès de l’EAS (European Atherosclerosis Society), Lion, 2-5 juin 2013. Communication affichée 5 De Paoli F, Copin C, Vanhoutte J, Zawadzki C, Jude B, Haulon S, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. The neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (NOR1) is induced in human alternative macrophages and controls the expression of alternative polarization markers. FEBS Advanced Lecture Course, Spetses summer school on nuclear receptor signalling in physiology and disease, Ile de Spetses (Grece), 25-30 aout 2013. Communication affichée De Paoli F, Copin C, Vanhoutte J, Zawadzki C, Jude B, Haulon S, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. The neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (NOR1) is induced in human alternative macrophages and controls the expression of alternative polarization markers. 12ème journée André Verbert, Lille, 11 septembre 2012. Communication affichée FINANCEMENT Bourse doctorale de l’Université Lille 2 accordée pour les 3 année de thèse FORMATIONS SUIVIES Bien utiliser les indicateurs bibliometriques en biologie-santé (facteur d’impact, h-index, sigaps) du 16 octobre 2014 Doc’Emploi du 13 novembre 2014 Guided Microarray data analysis (Partek) du 12 septembre 2013 Séminaire Athérosclérose: Nutrition et prevention du risque cardiovasculaire, 20-22 septembre 2012 6 RESUME Etude de l’expression et du rôle de NOR1 dans les macrophages alternatifs humains NOR1 (NR4A3) avec deux autres membres, Nurr1 et Nur77, fait partie de la famille des récepteurs nucléaires NR4A. Les trois récepteurs sont exprimés par les macrophages au sein de la lésion d’athérosclérose humaine. Cependant, l’expression et le rôle de NOR1 dans les macrophages alternatifs n’ont pas encore été étudiés. En utilisant le modèle in vitro de macrophages primaires alternatifs humains polarisés en présence d’IL-4, nous avons démontré que l’expression de NOR1 est induite dans les macrophages M2, une régulation pas observée chez la souris. D’ailleurs, l’expression de NOR1 est plus importante dans les zones de la lésion athérosclérotique humaine enrichies en macrophages alternatifs CD68+MR+. En utilisant l’approche de diminution de l’expression de NOR1 par un siRNA spécifique, nous démontrons que l’expression de certains marqueurs de la polarisation alternative tels que Mannose Receptor (MR), Interleukin-1 receptor antagonist (IL1Ra), CD200 receptor (CD200R), coagulation factor XIII A1 polypeptide (F13A1), interleukin 10 (IL10) et Peroxisome Proliferator- Activated Receptor (PPAR) est diminuée. Des analyses bioinformatiques ont identifié les gènes F13A1, IL-1Ra, IL-10 et la matrix metallopeptidase 9 (MMP9), comme étant des cibles potentielles de NOR1 dans les macrophages alternatifs humains. De plus, l’expression et l’activité enzymatique de la MMP9 sont induites suite au silencing de NOR1, une régulation confirmée par l’approche de surexpression de NOR1 par infection adénovirale. Ces données identifient NOR1 comme un facteur de transcription présent dans les macrophages alternatifs humains capable de modifier leur phénotype alternatif. Etude de l’expression et des fonctions potentielles de TLE1 dans les macrophages alternatifs TLE1, appartenant à la grande famille appelée « Groucho » chez la Drosophile, est connu pour être un répresseur de la transcription incapable de se fixer directement à l’ADN et que par conséquence agit après interaction avec d’autres facteurs de transcription. Aucune donnée n’est disponible quant à l’expression ni aux fonctions de TLE1 dans les macrophages humains. Nos résultats montrent que TLE1 est parmi les facteurs de transcription les plus exprimés dans les macrophages alternatifs humains comparativement aux macrophages non polarisés, une induction aussi observée dans les macrophages de souris. Nous avons aussi montré que TLE1 est fortement exprimé dans les zones enrichies en macrophages M2 au sein de la plaque athérosclérotique humaine ainsi que dans les macrophages à phénotype mixte qui infiltrent le tissu adipeux chez les sujets obèses. Nous avons suggéré un rôle potentiellement anti-inflammatoire pour TLE1. En fait, lorsque son expression est diminuée par une approche de siRNA, l’expression de certains marqueurs de la polarisation alternative (tels que IL-10 et IL1Ra) diminue tandis que l’expression de certaines cytokines pro-inflammatoires augmente en réponse à la stimulation par le LPS. Nous avons ensuite caractérisé l’expression génique de TLE1 dans les patients obèses avec ou sans diabète et nous montrons que l’expression de TLE1 varie selon le statut métabolique du donneur. L’ensemble de ces résultats préliminaires, mettant en évidence TLE1 comme un nouvel acteur d’intérêt dans les macrophages, mérite d’être confirmé et complété par des nouvelles expériences. 7 ABSTRACT The neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1) is highly expressed in human alternative macrophages where it induces the expression of markers of the M2 phenotype. The neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1), together with Nur77 and Nurr1, is a member of the NR4A orphan nuclear receptor family expressed in human atherosclerotic lesion macrophages. However, the expression and functions of NOR1 in human alternative macrophages have not been studied yet. Using an in vitro model of IL-4 polarized primary human alternative macrophages we demonstrate that NOR1 expression increased in alternative M2 macrophages compared to unpolarized macrophages in humans but not in mice, likely via STAT6 binding to a response element in the human NOR1 promoter, as demonstrated by electrophoretic mobility shift assays. Moreover, NOR1 expression is also more abundant in CD68+MR+ alternative macrophage-enriched areas of human atherosclerotic plaques in vivo. Silencing NOR1 expression in human alternative macrophages decreases the expression of a panel of M2 markers such as the Mannose Receptor (MR), Interleukin-1 receptor antagonist (IL1Ra), CD200 receptor (CD200R), coagulation factor XIII A1 polypeptide (F13A1), Interleukin 10 (IL10) and the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR). Bioinformatical analysis identified F13A1, IL-1Ra, IL-10 and the Matrix Metalloproteinase-9 (MMP9) as potential target genes of NOR1 in human alternative macrophages. Moreover, expression and enzymatic activity of MMP9 are induced by NOR1 silencing in M2 macrophages, a regulation confirmed in NOR1 gain of function experiments. These data identify NOR1 among the transcription factors induced during alternative differentiation of human macrophages and demonstrate that NOR1 modifies the alternative macrophage phenotype. Study of the expression and potential functions of TLE1 in human alternative macrophages. TLE1 is a member of the Groucho family and it is mainly described as a transcriptional co-repressor. Although lacking DNA binding activity of its own, this protein is recruited to gene promoters through interaction with other factors. No data are available regarding the expression or the role of TLE1 in human macrophages. Our results show that TLE1 is among the highest expressed transcription factors in human alternative macrophages, a regulation verified also in murine macrophages. Histological analysis showed that TLE1 expression in human carotid atherosclerotic lesions in vivo co-localizes with the macrophage marker CD68 and the alternative maker MR. Q-PCR analysis of macrophage-enriched areas isolated by LCM showed that the mRNA levels of TLE1 are higher in zones of alternative CD68+MR+ macrophages compared to zones enriched in CD68+MR- macrophages. Moreover, we have shown that TLE1 expression is higher in adipose tissue macrophages compared to resting macrophages differentiated from blood monocytes of the same obese subjects. We have suggested a potential anti-inflammatory role for TLE1; indeed, when its expression is decreased by a siRNA approach, the expression of some alternative markers (IL-10 and IL-1Ra) is decreased while the expression of pro-inflammatory genes (TNF, IL-6 and CCL3) is increased in response to LPS. Finally, we have characterised the mRNA expression of TLE1 in obese patients affected or not by diabetes and we have shown that TLE1 expression is influenced by the metabolic state of the patients. These preliminary data, identifying TLE1 as a novel potential actor in macrophages, need to be confirmed and completed by novel experiments. 8 TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS ..................................................................................................................................................... 3 LISTE DES PUBLICATIONS ................................................................................................................................... 5 RESUME ......................................................................................................................................................................... 7 ABSTRACT .................................................................................................................................................................... 8 LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................................... 13 LISTE DES ABBREVIATIONS.............................................................................................................................. 14 AVANT PROPOS ...................................................................................................................................................... 17 INTRODUCTION 1. L’ATHEROSCLEROSE ....................................................................................................................................... 19 1.1 Une maladie chronique de la paroi artérielle : définition ................................................................ 19 1.2 Structure de la paroi vasculaire ................................................................................................................. 19 1.2.1 l’Intima ....................................................................................................................................................... 21 1.2.2 La media .................................................................................................................................................... 21 1.2.3 L’adventice ............................................................................................................................................... 21 1.3 Accumulation et modification des lipoprotéines dans l’intima artérielle .................................. 22 1.4 L’activation des cellules endothéliales ........................................................................................ 22 1.5 L’athérosclérose, une pathologie inflammatoire ....................................................................... 23 1.6 Les macrophages et l’homéostasie du cholestérol ..................................................................... 23 1.7 Progression de l’athérosclérose et formation de la chape fibreuse ......................................... 25 1.8 Stabilité de la plaque et rupture: le rôle clef des cellules musculaires lisses ........................ 25 1.9 Immunité adaptative dans l’athérosclérose: le rôle clef des lymphocytes ............................. 28 1.10 Les facteurs de risque................................................................................................................... 29 1.10.1 Facteurs environnementaux ............................................................................................................... 29 1.10.2 Les dyslipidémies ................................................................................................................................. 29 1.10.3 Résistance à l’insuline et diabète......................................................................................... 30 2. LES MONOCYTES.......................................................................................................................... 31 2.1 Les différentes cellules du système immunitaire........................................................................ 31 2.1.1 Les neutrophiles ..................................................................................................................................... 31 2.1.2 Les cellules dendritiques ....................................................................................................................... 31 2.1.3 Les basophiles, mastocytes et éosinophiles .......................................................................... 31 2.1.4 Les macrophages .................................................................................................................... 31 2.2 Les monocytes .................................................................................................................................. 32 2.3 Hétérogénéité des monocytes ........................................................................................................ 32 2.4 Recrutement des monocytes ......................................................................................................... 34 3. LES MACROPHAGES ET LEURS PHENOTYPES FONCTIONNELS .............................. 35 3.1 Les macrophages ............................................................................................................................. 35 3.2 La polarisation in vitro des macrophages.................................................................................... 35 3.2.1 Les macrophages M1 ............................................................................................................................ 35 3.2.2 Les macrophages M2 ............................................................................................................................. 36 3.2.3 Les macrophages Mø1 et Mø2 ............................................................................................. 37 3.2.4 Les macrophages M4 ............................................................................................................. 37 3.3 Focus sur la polarisation alternative des macrophages ............................................................ 37 3.3.1 La voie de signalisation de l’IL4 et de l’IL-13 ............................................................................... 37 9