Universidade de Brasília Instituto de Biologia Departamento de Biologia Celular Pós-graduação em Biologia Molecular RIQUEZA DO DOMÍNIO ARCHAEA NO SOLO DO BIOMA CERRADO ELISA CATÃO CALDEIRA PIRES Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação de Biologia Molecular do Departamento de Biologia Celular, Instituto de Biologia, Universidade de Brasília, para obtenção do título de Mestre em Biologia Molecular. Orientador: Cynthia M. Kyaw 2012 Universidade de Brasília Instituto de Biologia Departamento de Biologia Celular Pós-graduação em Biologia Molecular RIQUEZA DO DOMÍNIO ARCHAEA NO SOLO DO BIOMA CERRADO ELISA CATÃO CALDEIRA PIRES Dissertação aprovada pela banca: Dra. Cynthia M. Kyaw (orientadora) (Universidade de Brasília) Dra. Cristine Chaves Barreto (Universidade Católica – Brasília) Dr. Robert Miller (Universidade de Brasília) Brasília, 2012 ii Tenho muito orgulho dos meus pais. Não poderia ter melhores exemplos a seguir. A estes, minhas linhagens ancestrais, eu dedico esta dissertação. Apesar de ser um ramo filogeneticamente mais recente, meu irmão, Francisco, é componente imprescindível da minha árvore e a quem dedico também este trabalho. iii AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar quero agradecer ao Woese e aos seus colaboradores pelo seu brilhante trabalho de “descoberta” e proposta de criação de um novo Domínio de vida: Archaea. Agradeço à minha orientadora, Cynthia Kyaw, por sua paciência, humildade, carinho e apoio constantes, cuja orientação sempre se faz presente. Sem dúvida admiro seu conhecimento notável sobre microbiologia e biologia molecular. Ainda quero aprender a identificar bactérias em placa só de olhar e medir OD pelo “olhômetro”. Agradeço aos professores colaboradores da pesquisa Ricardo Krüger, Mercedes Bustamante e Cristine Barreto pela ajuda na condução dos experimentos. Posso dizer com segurança que meu trabalho é dos mais prazerosos que existe. Meu dia-a-dia é divertido por causa dos meus companheiros de laboratório: Julianna Peixoto, Helena Magaldi, Cecília Kosmann e Thiago Rodrigues. Por isso a eles agradeço a companhia, a ajuda, as piadas e todas as contribuições intelectuais. E agradeço ao mestrado por ter me apresentado uma das minhas melhores amigas: a Julianna Peixoto, mulher super inteligente que eu admiro, e que sempre me anima. Queria agradecer às minhas amigas e professoras particulares, Alinne Castro e Regina Sartori, pela didática, paciência e carinho. Devo agradecer ao amigo e colega André Bertran por me auxiliar na preparação de células competentes e ao professor Renato Rezende por ceder seu laboratório todas as vezes que necessitei fazer eletroporação. Agradeço à professora Silviene por ter em seu laboratório um aparelho NanovueTM (GE) disponibilizado para o uso comum e às suas alunas Tatiana dos Anjos e Mariana Marzullo por me auxiliarem com o uso do aparelho. Obrigada ao aluno de doutorado Marcus Teixeira e à técnica Adriane Oliveira por realizarem o sequenciamento das minhas placas no Laboratório de Biologia Molecular. iv O maior obrigado devo aos meus pais. Busco neles toda a inspiração, perseverança e prazer no trabalho. Impossível observar minha mãe querida, mulher batalhadora, e não querer ser uma grande profissional. E também não consigo observar meu pai, professor da UnB, com grandes projetos de pesquisa, sem querer seguir o mesmo caminho. Neste sentido agradeço também à minha dinda, tia Helena Catão, antropóloga e pesquisadora também, que me aconselhou ao longo do mestrado. Um obrigado especial ao meu melhor amigo: meu irmão. Incrivelmente inteligente e maduro que me ouve mais do que qualquer um quando preciso. Pode parecer ridículo, mas como pesquisa é trabalhar em casa também, quero agradecer à minha maior companheira, minha gata Marie, por me fazer sempre sorrir. Obrigado meninas! Minhas melhores amigas: Renata, Carol e Rapha. À Carol, bióloga, com quem sempre aprendo um pouco mais sobre evolução. À Rê e à Rapha por mesmo sem entender quase nada do que eu falo sempre me escutam mesmo que em meio a risadas. Agradeço ao Felipe, que me apoiou no início do meu mestrado e que me lembrou nas vezes que precisei porque gosto de fazer pesquisa. Citando: “Você gosta muito de trabalhar com seus bichos microscópicos (ou com o DNA desses bichos, que é pior ainda!)”. Agradeço à perua-amiga Carmen e ao meu grande amigo Pablo Antunes por confiarem no meu perfil de pesquisadora. Meu obrigado vai também para meu amigo e conselheiro, Flávio Eiró, que me ajuda sempre nas minhas crises. v "If at first the idea is not absurd then there is no hope for it" Einstein “—a new scientific truth does not triumph by convincing its opponents and making them see the light, but rather because its opponents eventually die, and a new generation grows up that is familiar with it.” Max Planck vi LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1. Árvore filogenética universal, baseada em sequências de rRNA 16S e 18S, revelando os Domínios Archaea, Bacteria e Eucarya (Woese et al., 1990). ................. 10 Figura 2. Árvore filogenética de Archaea. ..................................................................... 15 Figura 3. Árvore filogenética de Archaea baseada em proteínas ribossomais. ............. 16 Figura 4. Esquema dos tipos de vegetação do bioma Cerrado. ................................... 20 Figura 5. Esquema da amostragem de um transecto. Cedido por Alinne Castro. ......... 23 Figura 6. Esquema do gene de 16S rRNA, suas regiões variáveis e as posições de anelamento dos iniciadores. .......................................................................................... 24 Figura 7.Precipitação mensal (em mm) registrada na Reserva Ecológica do IBGE Brasília-DF, em 2010. (http://www.recor.org.br/Estacao/consulta.asp) ........................ 32 Figura 8. Perfil eletroforético, em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, do DNA metagenômico extraído das amostras de solo das fitofisionomias cerrado denso (CDa, CDb) e mata de galeria (MGa, MGb), em duplicata. ........................................... 34 Figura 9. Perfil eletroforético, em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, dos produtos amplificados no experimento de PCR empregando os iniciadores 21F e 958R.. ............................................................................................................................ 36 Figura 10. Perfil eletroforético, em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, do DNA plasmidial de clones aleatoriamente selecionados a partir das bibliotecas de rDNA das amostras de solo.. .................................................................................................. 38 Figura 11. Histograma da classificação taxonômica das sequências de gene de 16S rRNA de cerrado denso (CDa, CDb) e mata de galeria (MGa, MGb).. ......................... 40 Figura 12. Diagrama de Venn representando o número de OTUs (3%) exclusivas em cada réplica e compartilhadas entre estas, para CD e MG.. ......................................... 46 Figura 13. Diagrama de Venn representando o número de OTUs (3%) exclusivas a cada fitofisionomia e compartilhadas entre estas. ......................................................... 48 Figura 14. Curvas de rarefação com as porcentagens de dissimilaridade de 3%, 5%, 10%, 20%. Curva de CD e Curva de MG. ..................................................................... 49 vii Figura 15. Curva de rarefação de todas as áreas com o limite de 3% de diferença. .... 50 Figura 16. Gráfico de Análise das Principais Coordenadas (PCA) construído no programa Unifrac (Lozupone et al., 2006) para demonstrar agrupamento em quadrantes dos ambientes amostrados. ....................................................................... 55 Figura 17. Árvores filogenéticas construídas a partir dos representantes de cada OTU (3%) das amostras CD e MG e CD+MG, após alinhamento com sequências de diferentes isolados de Archaea. .................................................................................... 62 Tabela 1.Características gerais de Bacteria, Archaea e Eukarya ................................. 11 Tabela 2. Iniciadores utilizados ..................................................................................... 24 Tabela 3. Reagentes e respectivas concentrações finais na reação de PCR ............... 24 Tabela 4. Propriedades físico-químicas das amostras de solo ..................................... 33 Tabela 5.Concentração de DNA extraído das amostras de solo. .................................. 34 Tabela 6. Número de sequências, OTUs (3%) e singletons por comunidade. .............. 45 Tabela 7 Índices de riqueza (Ace e Chao) e diversidade (simpson e shannon) para as duas fitofisionomias ....................................................................................................... 52 Tabela 8.Teste de hipótese Libshuff entre as amostras de cerrado denso e mata de galeria. .......................................................................................................................... 54 viii Resumo ........................................................................................................................................................ 1 Abstract ........................................................................................................................................................ 2 1. Introdução ............................................................................................................................................ 3 2. Objetivos .............................................................................................................................................. 5 2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................................. 5 2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................................ 5 3. Revisão Bibliográfica ......................................................................................................................... 6 3.1. Uso de ácidos nucléicos na classificação de organismos ................................................... 6 3.2. O Domínio Archaea ................................................................................................................... 9 3.3. Microrganismos no solo .......................................................................................................... 18 3.4. Solo de Cerrado ....................................................................................................................... 19 4. Materiais e Métodos ......................................................................................................................... 22 4.1. Coleta do solo ........................................................................................................................... 22 4.2. Extração de DNA genômico total ........................................................................................... 23 4.3. Iniciadores utilizados e condições de PCR .......................................................................... 23 4.4. Purificação e ligação das sequências de rDNA em vetor pGEM-T Easy ........................ 25 4.5. Preparação de células competentes de Escherichia coli DH5α e transformação ......... 26 4.5.1. Por choque térmico .......................................................................................................... 26 4.5.2. Por eletroporação ............................................................................................................. 27 4.6. Seleção de clones recombinantes ......................................................................................... 28 4.7. Extração de DNA plasmidial em pequena escala ............................................................... 28 4.7.1. PureLinkTM Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen) ......................................................... 28 4.7.2. Protocolo de lise alcalina ................................................................................................ 28 4.8. Quantificação da concentração do DNA .............................................................................. 29 ix 4.9. Sequenciamento de DNA........................................................................................................ 29 4.10. Análises de Bioinformática .................................................................................................. 30 5. Resultados e Discussão .................................................................................................................. 32 5.1. Coleta de solos ......................................................................................................................... 32 5.2. Extração de DNA total ............................................................................................................. 34 5.3. Amplificação de sequências de DNA relativas ao gene de 16S rRNA ............................ 35 5.4. Transformação de E. coli DH5α com fragmentos do gene de 16S rRNA e seleção de clones recombinantes .......................................................................................................................... 37 5.5. Extração de DNA plasmidial em pequena escala ............................................................... 37 5.6. Análises de bioinformática ...................................................................................................... 38 5.6.1. Análise de qualidade das sequências ............................................................................... 38 5.6.2. Classificação taxonômica pelo Ribosomal Database Project ....................................... 39 5.6.3 Estimativa de riqueza e alfa-diversidade .......................................................................... 42 5.6.4. Análises estatísticas de beta-diversidade ........................................................................ 53 5.6.5. Árvores filogenéticas............................................................................................................ 56 6. Considerações finais ....................................................................................................................... 65 7. Conclusões e perspectivas ............................................................................................................. 67 8. Referências Bibliográficas .............................................................................................................. 68 ANEXO I. Trabalhos apresentados em congresso ............................................................................. 82 x