Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Atuação da manifestação bacteriana no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage Katherine Derlene Batagin Piotto Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Fisiologia e Bioquímica de Plantas Piracicaba 2013 Katherine Derlene Batagin Piotto Engenheira Florestal Atuação da manifestação bacteriana no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011 Orientador: Prof. Dr. MARCÍLIO DE ALMEIDA Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Fisiologia e Bioquímica de Plantas Piracicaba 2013 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP Piotto, Katherine Derlene Batagin Atuação da manifestação bacteriana no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage / Katherine Derlene Batagin Piotto.- - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2013. 157 p: il. Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2013. 1. Bactérias 2. Clonagem 3. Eucalipto 4. Fertilização "in vitro" 5. Fixação de nitrogênio 6. Micropropagação vegetal 7. Microrganismos endofíticos I. Título CDD 634.9734 P662a “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” 3 Aos meus queridos padrinhos, amigos e pais científicos Cristina e Marcílio de Almeida Ofereço À minha família, Meu esposo Fernando, aos meus pais Erivelto e Suely e aos meus irmãos Augusto e Gustavo por todo amor, carinho, dedicação, por sempre acreditarem em mim e nunca medirem esforços para que esse sonho um dia se concretizasse, Dedico. 4 5 AGRADECIMENTOS Este trabalho representa a concretização de um grande sonho, acalentado durante anos e seria impossível realizá-lo sem o apoio das pessoas e instituições que menciono a seguir, com enorme gratidão. Primeiramente a Deus, pelo dom da vida e por todas as maravilhas que tem feito por mim. Ao orientador, padrinho e pai científico, Prof. Dr. Marcílio de Almeida, agradeço imensamente por todos esses anos de orientação, dedicação, amizade e confiança em mim depositados. À Dra. Cristina Vieira de Almeida, minha querida madrinha por ser muito mais que uma co-orientadora, por ser uma mãe para mim, agradeço por todo carinho, amor, amizade e pela imensa colaboração nas correções deste trabalho. Ao Prof. Fernado Dini Andreote, pela colaboração e auxílio na execução desse trabalho. Ao Prof. Antonio Natal Gonçalves e ao Prof. Ricardo Antunes de Azevedo, pela colaboração e disponibilização de seus laboratórios. Ao amigo José Roberto Romanini (Beto) por toda ajuda, pelas altas risadas e por sempre me auxiliar em tudo, sou-lhe imensamente grata. Ao doutorando Fábio Lino Soares Júnior (Dig) por toda ajuda, colaboração e paciência a cada dúvida minha. À Maria Solizete Granziol Silva, pela atenção e carinho dedicados durante todos esses anos de pós-graduação. À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP) e ao Departamento de Ciências Biológicas, a toda equipe de secretários e assistentes pela eficiência e colaboração nos serviços prestados em todos os momentos. A CAPES pela bolsa concedida durante todo o curso. À Faculdade de Ciência Sociais e Agrárias de Itapeva (FAIT) por contribuir na minha formação. Aos meus pais Erivelto e Suely Batagin, que são a razão do meu viver. Mesmo estando longe, participaram, como sempre, ativamente na minha vida. Vocês são o meu porto seguro, obrigada por todas as noites que me ouviram chorar e por todas que vibraram pelas minhas conquistas, por todo amor, confiança e incêntivo, que me fizeram ser perseverante em busca desse sonho. Amo vocês!!! 6 Aos meus amados e queridos irmãos Augusto e Gustavo, que sempre estiveram em meus pensamentos e no meu coração. Amo demais vocês!!! Ao meu melhor amigo, companheiro, confidente e esposo Fernando Angelo Piotto, por todo carinho, atenção e amor. Pelas noites em claro comigo no laboratório, sempre me auxiliando, me incentivando, me escutando, bem como pela paciência e intensa colaboração na construção e realização desse sonho. A todos os meus familiares, pela compreensão e amor, em especial às minhas tias Sônia, Marisa, Milva e ao meu avô Zacarias por toda ajuda e incêntivo desde a minha graduação. Ao meu avô Augusto e minhas avós Maria e Lourdes que lá do céu me acompanham, sempre estiveram e estarão em meu coração. A minhas queridas cunhadas Eline e Najela, por toda amizade e carinho. A minha segunda família, seu Sebastião e Mara Piotto, as minhas queridas cunhadas Tania e Flavia, e as minhas pequeninas Maria Laura e Marjorie, obrigada por me tornar parte dessa família tão maravilhosa. A minha família “morfogênese”, meus estimados amigos de laboratório Érika, Eveline, Fabiane, Francisco, Gabriela, Germana, Gilvano, Leandro, Lívia, Marilia, Natália, Priscila, Rafaella, Raquel que são muito mais que amigos, são como irmãos para mim. Aos meus queridos amigos do Polo de Licenciatura em Ciências/USP, Profa Taitiany Bonzanini, Prof. Quirino Carmello, Profa Rosebelly Marques, Carol, Cindy, Emerson, Helen, Isabela, Michel, Reinaldo, Rodrigo, Rosilda, Thomas, Vanessa e Valéria. As minhas amigas Débora, Solange, Shirley, Vânia e Tais, que mesmo longe sempre estarão no meu coração. Sei que muitas foram as minhas falhas durante a vida e posso estar falhando neste momento, esquecendo-me de alguém, por esse motivo peço desculpas, e agradeço a todas as pessoas que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse trabalho. Aquele que por ventura tenha esquecido e por qualquer que tenha sido a sua contribuição, sou-lhe muito grata. 7 “Mude as suas opiniões, mantenha os seus princípios, troque suas folhas e mantenha suas raízes” Victor Hugo 8 9 SUMÁRIO RESUMO................................................................................................................... 13 ABSTRACT ............................................................................................................... 15 LISTA DE ILUSTRAÇÕES ....................................................................................... 17 LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 23 LISTA DE QUADROS ............................................................................................... 25 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 27 2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 31 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 33 3.1 Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage .......................................................... 33 3.2 Propagação clonal de Eucalyptus ....................................................................... 35 3.3 Cultivo in vitro ...................................................................................................... 36 3.4 Morfogênese x Fitorreguladores .......................................................................... 39 3.5 Interação endófito x plantas ................................................................................ 41 3.6 Inoculação artificial de bactérias endofíticas (Bacterização) ............................... 44 3.7 Micropropagação x Endófitos .............................................................................. 46 3.8 Estresse oxidativo .............................................................................................. 49 4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 53 4.1 Infraestrutura ....................................................................................................... 53 4.2 Material vegetal .................................................................................................. 53 4.3 Micropropagação ................................................................................................ 54 4.3.1 Fonte de explantes ........................................................................................... 54 4.3.2 Desinfestação dos explantes ........................................................................... 55 4.3.3 Introdução in vitro ............................................................................................ 55 4.3.4 Subcultivos ...................................................................................................... 55