Réponses cellulaires vis-à-vis de l’exposition au cadmium chez les animaux Estelle Rousselet To cite this version: EstelleRousselet. Réponsescellulairesvis-à-visdel’expositionaucadmiumchezlesanimaux. Biologie cellulaire. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2007. Français. ￿NNT: ￿. ￿tel-00584238￿ HAL Id: tel-00584238 https://theses.hal.science/tel-00584238 Submitted on 7 Apr 2011 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. UNIVERSITE JOSEPH FOURIER-GRENOBLE 1 THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER Discipline : BIOLOGIE Présentée et soutenue publiquement Par Estelle ROUSSELET Réponse cellulaire vis-à-vis de l'exposition au cadmium chez les animaux Thèse soutenue le 29 octobre 2007 devant le jury composé de : Prof. Alain FAVIER Président Prof. Pierre MIRAMAND Rapporteur Dr. Philippe POGNONEC Rapporteur Dr.Sylvie CHEVILLARD Examinatrice Dr. Florent GUILLAIN Directeur de thèse Dr. Jean-Marc MOULIS Directeur de thèse REM ERCIEM ENTS Le travail présenté dans ce rapport a été effectué dans le laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux anciennement laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire du Commissariat à l’Energie Atomique de Grenoble. Je tiens à remercier Florent Guillain pour m’avoir accueillit au sein de son laboratoire, ainsi que pour sa gentillesse et son sens de l’humour. Je tiens ensuite à remercier les membres de mon jury de thèse pour m’avoir fait l’honneur d’accepter d’examiner mon travail. Je souhaite ensuite remercier tout particulièrement Jean-Marc Moulis. Merci Jean-Marc de m’avoir donné la possibilité de travailler avec toi et d’effectuer cette thèse, de m’avoir fait confiance dans toute la réalisation de ce travail. Merci pour ta disponibilité, ta franchise, ta patience et ton soutien. Je remercie Jacques Meyer pour son soutien ainsi que sa femme Christine. Un grand merci pour toutes les personnes avec lesquelles j’ai pu collaborer lors de mon travail de thèse et qui m’ont permis de m’ouvrir à une autre manière d’aborder un problème, merci au docteur Sylvie Chevillard de m’avoir donné l’opportunité de travailler dans son laboratoire du CEA de Fontenay-aux-Roses et à toute son équipe, avec une mention spéciale pour Nicolas Ugolin que j’ai souvent sollicité pour la compréhension du traitement des données bio- informatiques ; merci à Thierry Douki, Jocelyne Chantegrel et Olivier Falletti ; à Thierry Rabilloud et Mireille Chevallet, à Muriel Viau et Serge Candéias et enfin à Pierre Richaud et Alexandre Bouron. Merci à tous pour votre aide et pour tout ce que nos discussions m’ont apporté. Je remercie Camille et Alain, avec qui j’ai travaillé au quotidien pendant deux ans, ainsi que Christel. Merci à vous deux, Christel et Camille pour votre réconfort dans les moments difficiles et pour les moments de rire intense qu’on a partagé. Merci à Lilie qui m’a toujours soutenue, à Caro (il en a deux), Béa, Julien, Heidi et Sandrine, Peggy, Pat, Martine, enfin bref, tous ceux qui font que le labo devient notre seconde maison… A ma famille, et ma seconde famille, pour leur soutien et leur amour. Et enfin à toi, mon Amour, mon Mana, qui m’a toujours soutenu dans mes projets et mes choix. A mon Mana, SOMMAIRE INTRODUCTION I. Les pathologies liées à l’exposition au cadmium……………...…………….19 I-1 Présentation du cadmium ………………………………………………………...19 I-2 Lésions hépatiques et rénales .……………………………………………………20 I-3 Pathologies osseuses……………………………………………………………....22 I-4 Pathologies pulmonaires…………………………………………………………..24 II. Systèmes d’Entrée-Sortie cellulaires du cadmium………………………….25 II-1 Divalent Metal Transporter 1 …………………………………………………...25 II-2 Les transporteurs du zinc ………………………………………………..………26 II-3 Les canaux calciques .…………………………………………………………....29 II-4 Les pompes d’efflux ……………………………………………………………..30 II-5 Les transporteurs de manganèse ………………………………………………....34 II-6 Récapitulatif des systèmes d’entrée et de sortie cellulaire du cadmium…………35 III. Mécanismes de toxicité moléculaires du cadmium……….………………..37 III-1 Interférence avec l’homéostasie des métaux essentiels ...……………………....37 III-2 Production d’Espèces Réactives de l’Oxygène par le cadmium ….…….………38 III-2 a. Présentation du stress oxydant…………………………………….…………...……..38 III-2 b Mécanismes antioxydants……………………………………………………….…….40 III-2 c Effets du cadmium sur la production de ROS ......…….……………………….……..42 III-2 d Les ROS : signaux moléculaires………………………….…………………….……..44 III-3 Effets du cadmium sur la régulation des gènes …………………………………46 III-3 a Induction des métallothionéines (MT) ………………………………………………..46 III-3 b Metal-responsive element-binding transcription factor-1 MTF-1 …………………...49 III-3 c Induction de la synthèse du glutathion ……………………………………..……........51 III-3 d Induction de l’hème oxygénase-1 ………………………………………….….…...…52 III-3 e Suppression de l’activité de Sp1 (Specificity protein 1)…………………..…...…...…53 III-4 Rôle du réticulum endoplasmique (RE) dans les mécanismes moléculaires de résistance au cadmium………………………………………………………………………..54 III-4 a Présentation du RE…………………………………………………………………….54 III-4 b La réponse UPR……………………………………………………………………….55 III-4 c Les protéines de stress……………………………………………..………………….59 III-4 c1 Induction de l’expression des Hsp…………………………………….…59 III-4 c2 Rôle des Hsp vis-à-vis du stress cadmium……………………………….60 III-5 Effets du cadmium sur la signalisation cellulaire……………………………....64 III-5 a Activation de la voie de signalisation ERK…………………………………………..66 III-5 b Activation de la voie de signalisation JNK/SAPK…...………………………………67 III-5 c Activation de la voie de signalisation p38……………………………………………69 III-5 d Fonctions biologiques des voies de signalisation des MAPK………………………..70 III-5 e Rôle du cadmium dans la signalisation……………………….………………………72 IV. Objectifs du travail de thèse………………………………………………..75 CHAPITRE 1 : ETUDE DES MECANISMES DE RESISTANCE VIS-A-VIS DU CADMIUM D’UNE LIGNEE CELLULAIRE DERIVEE DE LA LIGNEE EPITHELIALE HELA. I-1. Etudes antérieures des mécanismes de résistance vis-à-vis du cadmium….78 I-2. Présentation du modèle cellulaire utilisé…………………………………..81 I-3. Présentation des axes de travail……………………………………………82 I-4. ARTICLE 1: Resistance to high zinc concentrations of a human epithelial cell line imparts them with insensitivity to large cadmium challenges………..84 I-5. Résumé de l’article 1…………………………………………………..…127 I-6.1 Effets du cadmium sur les deux lignées cellulaires HeLa et HZR…..……….127 I-6.2 Rôle du zinc dans la résistance vis-à-vis du cadmium ……………………....128 I-7.2 Informations obtenues sur l’origine de la résistance des cellules HZR vis-à-vis du cadmium………………………………………………………………………………….129 I-6. Résultats complémentaires………………………….……………………131 I-6.1 Mort cellulaire et dommages à l’ADN……………………………………….134 I-6.2 Etude des réponses calciques des deux lignées cellulaires HeLa et HZR…....134 I-6.2 a Mise en évidence de la présence de canaux capacitifs d’entrée du calcium..………134 I-6.2 b Mise en évidence de l’entrée de cadmium………………………………………….136 I-6.2 c Tests d’inhibition de l’entrée de cadmium………………………………………….140 I-7. Mécanismes de toxicité du cadmium…………………………….………142 CHAPITRE 2 : ETUDE DE L’EFFET DU CADMIUM SUR L’HOMEOSTASIE DU FER CHEZ LES MAMMIFERES. II-1. Régulation de l’homéostasie du fer chez les mammifères……………....145 II-1.1 Le fer : un métal au rôle dual………………………….…….…………….…..145 II-1.2 Entrée du fer dans les cellules par endocytose……………………….….…….146 II-1.3 Système IRP/IRE : bio-marqueur du fer intracellulaire………………….……147 II-2. Présentation des axes de travail…………….……………………………150 II-3. ARTICLE 2: Effect of cadmium stress on the mammalian Iron Regulatory Proteins………………………………………………………………………..150 II-4. Résultats et discussion…………………………………………………...177 II-4.1 Comparaison entre les différentes études sur l’effet du cadmium et son interaction avec le fer in vivo et intérêt de notre étude. …………………………………….178 II-2.2 Interaction entre le cadmium et l’homéostasie du fer par comparaison entre les cellules épithéliales HeLa et les cellules résistantes au zinc……………………………..…178 II-2.3 Rôle d’un chélateur de fer : la desferrioxamine………………………….….180 CHAPITRE 3: EXAMEN DE QUELQUES ASPECTS MOLECULAIRES CONTRIBUANT AU PHENOTYPE DE LA LIGNEE HZR RESISTANTE AU ZINC ET COMPARAISON AVEC LA LIGNEE PARENTE HELA. ARTICLE 3: Cadmium resistance of mammalian cells by adaptation to zinc. Molecular insight by proteomic analysis…………………………………...…185 CHAPITRE 4 : ETUDE DE L’EFFET DU CADMIUM ET DU ZINC SUR LA REPONSE TRANSCRPIONNELLE DES CELLULES HZR. IV-1. Présentation des axes de travail….……………………………………..217 IV-2. Définition et principaux types de puces à ADN …………………...…..218 IV-3. Stratégie d’étude………………………………………………………..221 IV-3.1 Culture cellulaire et traitements …………………………………………...221 IV-3.2 Principe de l’hybridation sur puces………………………………………....223 IV-3.2 a La puce utilisée…………………………………………………………...………226 IV-3.2b Préparation des ARN (voir partie expérimentale)……..………………………….226 IV-4 Acquisition et analyse des données……………………………………..227 IV-4.1 Acquisition des images…………………….………………………………227 IV-4.2 Quantification et normalisation des rapports d’expression de gènes………227 IV-4.2 a Elimination du bruit de fond et calcul d’un facteur de robustesse……….………227 IV-4.2 b Calcul des rapports d’expression ...…………………….………………………..230 IV-4.2 c Normalisation………………………………….…………………………………231 IV-4.2 d Classement et ordonnancement des gènes………………….……………………231 IV-5 Résultats………………………………………………………….…….235 IV-5.1 Vérification du phénotype .……………………………………….………235 IV-5.2 Définitions……………………………………………………….………..237 IV-5.3 Détermination des gènes variants et invariants ……………….………….237 IV-5.3 a Gènes différentiellement exprimés……….………………………….…………..238 IV-5.3 b Validation de quelques gènes différentiellement exprimés………….………….248 IV-5.3 b1 Méthodologie…………………….……………………………..249 IV-5.3 b2 Validation des amorces……….………………………………...250 IV-5.3 b3 RT-PCR Quantitative…….…………………………………….253 IV-5.4 Examen des gènes régulés par MTF-1…………………………………….257 IV-5.5 Recherche des candidats responsables de la résistance des cellules HZR vis-à- vis du cadmium………………………………………………………………….…………258 IV-5.6 Examen des autres candidats différentiellement exprimés entre les conditions T0T24 vs –Zn………………………………………………………………………………262 IV-5.7 Aperçu succinct des analyses conduites sur les résultats des données d’expression. ……………………………………………………………..………….……...263 IV-5.8 Analyse globale des gènes régulés par la concentration de zinc dans les cellules HZR. Recherche de candidats pouvant expliquer le phénotype de ce clone.…..…..264 IV-5.9 Analyse globale des gènes régulés en présence de cadmium dans les cellules HZR. ……………………………………………………………………………………..….267 (cid:1) ajout de cadmium aux cellules cultivées en présence de zinc...………………….….267 (cid:1) manipulation du zinc sur des cellules exposées au cadmium…………………….…269 (cid:1) substitution du zinc par le cadmium………………………………………………...269 IV-5.10 Examen de gènes non inclus dans des réseaux biologiques………….…...272 IV-5.11 Conclusion : Caractéristiques générales de l’analyse transcriptomique globale réalisée pour les cellules HZR……………………………………………………....272 CONCLUSION GENERALE………………….…………….275 MATERIELS ET METHODES………………...……………285 TAMPONS……………………………………………….……………………………..….287 METHODES GENERALES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE……………..…….….287 Extraction de l’ADN par une solution de Phénol/Chloroforme/3-méthyl-1-butanol Préparation de la sonde IRE en présence de traceur radioactif METHODES GENERALES DE BIOCHIMIE………………………………….………288 Dosage de la concentration des protéines………..…………………………….……..288 Dosage de la concentration d’ADN (ARN)…………………………………….……..288 Analyse des protéines sur gel dénaturant de polyacrylamide………………………288 Analyse des protéines par immuno-empreinte…..……………………….………….289 CHAPITRE 1……………………………………………...………………………………..289 1.1 Cultures cellulaires………………………………...……………………………289 1.2 Détermination de la viabilité cellulaire…………………………………………289 1.3 Courbes de titrage de la sonde fluorescente BTC-5N en présence de zinc/cadmium 1.4 Localisation du cadmium intracellulaire par microscopie confocale….………...289 1.5 Mesure des cassures de l’ADN par la méthode des COMET………..………….289 1.6 Mesure de la 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine……………………………289