Maria de Fátima Silva de Resende QUEIJO MINAS ARTESANAL DA SERRA DA CANASTRA: INFLUÊNCIA DA ALTITUDE E DO NÍVEL DE CADASTRAMENTO DAS QUEIJARIAS NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS Dissertação apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Tecnologia e Inspeção de Produtos de Origem Animal. Orientador: Marcelo Resende de Souza Belo Horizonte Escola de Veterinária da UFMG 2010 R433 q Resende, Maria de Fátima Silva de, 1980- Queijo Minas artesanal da Serra da C anastra: influência da altitude e do nível de cadastramento das queijarias nas características físico-químicas e microbiológicas / Maria de Fátima Silva de Resende. - 2010. 72 p. : il. Orientador: Marcelo Resende de Souza Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária Inclui bibliografia 1. Queijo-de-minas - Análise - Teses. 2. Queijo-de-minas - Qualidade - Teses. 3. Queijo-de-minas - Microbiologia - Teses. I. Souza, Marcelo Resende de. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. III. Título. CDD - 637.3 2 3 4 AGRADECIMENTOS A Deus. A minha família. Ao meu orientador, Professor Marcelo Resende de Souza, pelos ensinamentos, confiança e amizade, desde a graduação. Ao meu co-orientador, Professor Álvaro Cantini Nunes, pela acolhida e importante contribuição a realização deste trabalho. Aos membros da banca de dissertação, Professores Jacques Robert Nicoli e Maria José de Sena, pelas sugestões e presença. À Professora Cláudia Penna pelo apoio e amizade. Aos professores do DTIPOA. Aos funcionários do DTIPOA – Evaldo, Fatinha, Marco Antônio, Maura, Miltinho, Taynara e Valéria - pela ajuda indispensável e paciência. Aos amigos de pós-graduação, Adriano Cunha, Alice Drummond, Bianca Seridan, Cláudio Paiva, Débora Pinheiro, Elisa Andrade, Fernanda Andrade, Hugo Costa e Isabela Oliveira. Obrigada por toda ajuda durante o experimento, pelos momentos de descontração e pela convivência maravilhosa e inesquecível. Aos meus “estagiários”, Guilherme Lamego, Leonardo Acúrcio, Mário Abatemarco e Vitor Viggiano, pela colaboração imprescindível durante a condução do experimento. Ao Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do ICB. A todos do Laboratório de Genética Molecular de Protozoários Parasitos do ICB, em especial ao João Moreira, pela disponibilidade e ajuda. Ao LabUFMG pela realização das análises de leite deste experimento. À EMATER-MG, especialmente Elmer Luiz de Almeida, Marinalva Soares e Viviani de Melo, pelo total apoio durante a realização deste projeto. A CAPES pela concessão da bolsa. A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. 5 SUMÁRIO RESUMO 11 ABSTRACT 12 1. INTRODUÇÃO 13 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14 2.1. Histórico da produção de queijos 14 2.2. Queijos artesanais do Brasil 15 2.3. Queijo Minas artesanal 15 2.3.1. Histórico 15 2.3.2. Aspectos legais da produção de Queijo Minas artesanal 15 2.3.3. Caracterização do queijo Minas artesanal 16 2.4. Queijo Minas artesanal da Serra da Canastra 17 2.4.1. Caracterização regional 17 2.4.2. Aspectos agroecológicos 18 2.4.3. Processo de produção do queijo 18 2.5. Qualidade dos queijos artesanais produzidos no Brasil 19 2.6. Bactérias ácido-lácticas (BAL) 21 2.7. Bactérias ácido-lácticas em queijos artesanais 22 3. MATERIAL E MÉTODOS 24 3.1. Aquisição do queijo Minas artesanal da Serra da Canastra e amostragem 24 3.2. Avaliação microbiológica e contagem de células somáticas de leite 25 3.3. Avaliação microbiológica do queijo Minas artesanal 25 3.3.1. Pesquisa de coliformes a 30°C e a 45°C 25 3.3.2. Pesquisa de Salmonella spp. 25 3.3.3. Pesquisa de Staphylococcus spp. 26 3.3.4. Pesquisa de bolores e leveduras 26 3.4. Isolamento, enumeração, caracterização fisiológica e purificação de bactérias 26 ácido-lácticas de leite, soro-fermento e queijo Minas artesanal 3.5. Identificação dos isolados de bactérias ácido-lácticas de leite, soro-fermento e 27 queijo Minas artesanal de acordo com técnicas de Biologia Molecular 3.6. Avaliação físico-química 30 3.6.1. Leite 30 3.6.2. Queijo Minas artesanal 31 3.7. Análise Estatística 31 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 31 4.1. Qualidade microbiológica e contagem de células somáticas do leite 31 4.2. Qualidade microbiológica do queijo Minas artesanal 34 4.3. Isolamento, enumeração e caracterização fisiológica de bactérias ácido-lácticas 38 de leite, soro-fermento e queijo Minas artesanal 4.3.1. Isolamento e enumeração 38 4.3.2. Caracterização fisiológica 41 4.4. Identificação de bactérias ácido-lácticas isoladas de leite, soro-fermento e 43 queijo Minas artesanal, de acordo com técnicas de Biologia Molecular 4.5. Qualidade físico-química de leite 49 4.6. Qualidade físico-química do queijo Minas artesanal 51 5. CONCLUSÕES 53 6. PERPESCTIVAS FUTURAS 54 6 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54 8. ANEXOS 64 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) da contagem 31 bacteriana total e da contagem de células somáticas de leite coletado em propriedades rurais, produtoras de queijo Minas artesanal, em diferentes altitudes na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 2 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) da contagem 32 bacteriana total e da contagem de células somáticas de leite coletado em propriedades rurais, produtoras de queijo Minas artesanal, não cadastradas e cadastradas pelo IMA na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 3 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) de parâmetros 34 microbiológicos de queijo Minas artesanal coletado em propriedades rurais em diferentes altitudes na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 4 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) dos parâmetros 34 microbiológicos de amostras de queijo Minas artesanal coletadas em propriedades rurais não cadastradas e cadastradas pelo IMA na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 5 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) das contagens de 38 BAL, isoladas em ágar MRS e ágar M17, em amostras de leite, soro- fermento e queijo Minas artesanal coletadas em propriedades rurais nas diferentes altitudes na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 6 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) das contagens de 39 BAL em amostras de leite, soro-fermento e queijo Minas artesanal coletadas em propriedades rurais não cadastradas e cadastradas pelo IMA na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 7 - Características fisiológicas (morfologia, coloração de Gram e teste de 42 catalase) de microrganismos isolados em meios MRS e M17 a partir de amostras de leite (n=18), soro-fermento (n=18) e queijo Minas artesanal (n=18) coletadas na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 8 - Bactérias ácido-lácticas isoladas em meios MRS e M17 a partir de 45 amostras de leite, soro-fermento e queijo Minas artesanal coletadas em propriedades rurais em diferentes altitudes na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 9 - Bactérias ácido-lácticas isoladas em meios MRS e M17 a partir de 46 amostras de leite, soro-fermento e queijo Minas artesanal coletadas em propriedades rurais não cadastradas e cadastradas pelo IMA na região da Serra da Canastra (MG) 7 Tabela 10 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) dos parâmetros 50 físico-químicos de 18 amostras de leite coletadas em propriedades rurais, produtoras de queijo Minas artesanal, em diferentes altitudes na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 11 - Resultados médios (x) e coeficientes de variação (CV) dos parâmetros 50 físico-químicos de 18 amostras de leite coletadas em propriedades rurais não cadastradas e cadastradas pelo IMA na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 12 - Resultados médios e coeficientes de variação (CV) dos parâmetros físico- 51 químicos de 18 amostras de queijo Minas artesanal coletado em propriedades rurais em diferentes altitudes na região da Serra da Canastra (MG) Tabela 13 - Resultados médios e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros físico- 52 químicos de 18 amostras de queijo Minas artesanal coletado em propriedades rurais não cadastradas e cadastradas pelo IMA na região da Serra da Canastra (MG) LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Parâmetros microbiológicos estabelecidos pelo Decreto n° 44.864, para 16 inspeção de queijo Minas artesanal, e determinados pela Portaria nº146, para queijos industrializados LISTA DE FIGURAS Figura 1 - PCR 16S-23S de DNA de algumas amostras de microrganismos 65 fermentadores de lactose, isolados de queijo de Minas artesanal da Serra da Canastra, em ágar MRS Figura 2 - PCR 16S-23S de DNA de algumas amostras de microrganismos 65 fermentadores de lactose, isolados de queijo de Minas artesanal da Serra da Canastra, em ágar M17 Figura 3 - Restrição enzimática de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada 67 como Lactobacillus casei Figura 4 - Restrição enzimática de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada 67 como Lactobacillus rhamnosus Figura 5 - Restrição enzimática de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada 68 como Lactobacillus hilgardii 8 Figura 6 - Restrição enzimática de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada 68 como Weissella paramesenteroides Figura 7 - Restrição enzimática de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada 69 como Lactobacillus plantarum/Lactobacillus paraplantarum Figura 8 - Produtos da amplificação da região do gene recA a partir da técnica de 69 PCR multiplex de algumas amostras de culturas identificadas como Lactobacillus plantarum/Lactobacillus paraplantarum ANEXOS Anexo 1 - Percentual de microrganismos isolados de leite, soro-fermento e queijo 64 Minas artesanal da Serra da Canastra (MG) que apresentaram crescimento nas condições de cultivo do teste respiratório Anexo 2 - Amplificação da região intergênica 16S-23S por PCR 65 Anexo 3 - Perfil de restrição enzimática dos fragmentos amplificados por PCR do 66 espaçador 16S-23S rDNA de diferentes espécies de BAL isoladas de amostras de leite, soro-fermento e queijo Minas artesanal da Serra da Canastra (MG) Anexo 4 - Restrição enzimática dos produtos de PCR 67 Anexo 5 - Contagem das populações de bactérias ácido-lácticas (UFC/g) isoladas de 70 18 amostras de queijo Minas artesanal da região da Serra da Canastra (MG) em ágar MRS Anexo 6 - Contagem das populações de bactérias ácido-lácticas (UFC/g) isoladas de 71 18 amostras de queijo Minas artesanal da região da Serra da Canastra (MG) em ágar M17 9 LISTA DE ABREVIATURAS µL Microlitros °D Graus Dornic ARDRA Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado BAL Bactérias ácido-lácticas BSA Albumina sérica bovina CBT Contagem bacteriana total CCS Contagem de células somáticas CO Dióxido de carbono 2 CV Coeficiente de variação DNA Ácido desoxirribonucléico EDTA Ácido etileno diamino tetracético EMATER-MG Empresa de Assistência Técnica e Extensão Rural de Minas Gerais ESD Extrato seco desengordurado EST Extrato seco total g Grama GES Gordura no extrato seco H Hidrogênio 2 H O Peróxido de hidrogênio 2 2 HCl Cloreto de hidrogênio IMA Instituto Mineiro de Agropecuária Kb Kilobase KCl Cloreto de potássio Kg Quilograma KH PO Fosfato monopotássico 2 4 L. Lactobacillus LabUFMG Laboratório de Análise da Qualidade do Leite da UFMG m Metros M Molar MG Minas Gerais mg Miligrama ml Mililitro mM Milimolar MRS Man, Rogosa e Sharpe N Nitrogênio 2 Na HPO Fosfato dissódico 2 4 NaCl Cloreto de sódio NMP Número mais provável PCR Reação de polimerização em cadeia rDNA DNA ribossomal rpm Rotações por minuto UFC Unidade formadora de colônia UFMG Universidade Federal de Minas Gerais V Volts W. Weissella 10