- Institut für Anatomie der Universität Leipzig - Die Dünnschnittplastination Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktor rerum medicinalium der Universität Witten/Herdecke im Bereich Medizin vorgelegt von Hanno Steinke aus Leipzig im Jahre 2005 Promotionskomitee: (Akademischer Titel, Vor- und Familienname) 1. Mitglied (Betreuer): Prof. Dr. med. G. Reiss 2. Mitglied: Prof. Dr. med. N. Krüger 3. Mitglied: Prof. Dr. med. K. Spanel-Borowski Gutachter: Tag der Disputation: Inhaltsverzeichnis 1. Einführung.......................................................................................1 1.1. Stand.................................................................................................1 1.2. Ziel vorliegender Arbeit.....................................................................2 2. Material und Methode.....................................................................7 2.1. Vorbehandlung..................................................................................7 2.1.1. Vorbehandlung fixierten Gewebes....................................................7 2.1.2. Vorbehandlung von unfixiertem Gewebe einer 64jährigen ...............9 2.1.3. Beispiele weiterer unfixierter Präparate ..........................................10 2.1.4. Farbige Injektion der Gefäße und farbige Einbettung .....................13 2.2. Untersuchung der Leiche mit BV.....................................................15 2.2.1. MRT 64 ♂........................................................................................15 2.2.2. MRT 64 ♀........................................................................................16 2.2.3. Beispiele weiterer unfixiert untersuchter Leichen............................16 2.3. Einfrieren und Sägen.......................................................................18 2.3.1. Die Einwirkung des Vorkühlens auf das Einfrieren .........................18 2.3.2. Die Wirkung des Einfrierprozesses auf das Scheibenplastinat.......19 2.3.3. Das Sägen von Dünnschnitten........................................................22 2.3.4. Verbesserung des Sägevorganges bei weiteren Untersuchungen.25 2.4. Entwässerung und Färbung............................................................27 2.4.1. Die Gewebsschrumpfung im Gefrieraustausch...............................28 2.4.2. Der gestaffelte Gefrieraustausch.....................................................32 2.4.3. Das Entfetten der Körperscheiben..................................................34 2.4.4. Einführung histologischer Färbemethoden beim Gefrieraustausch 35 2.5. Imprägnation...................................................................................38 2.5.1. Das Polymerisationsverhalten von Kunststoffflotten.......................38 2.5.2. Die Gewebsschrumpfung während der Imprägnation.....................41 2.5.3. Das adaptierte Imprägnieren von Körperscheiben..........................42 2.5.4. Das Einbetten der imprägnierten Körperscheiben ..........................42 2.6. Polymerisation.................................................................................44 2.6.1 Härte und Flexibilität von DSP........................................................44 2.6.2. Das Tempern...................................................................................44 2.6.3. Die Farberhaltung gefärbter DSP....................................................45 2.7. Digitalisierung/Korrelation...............................................................46 2.7.1 Fotografie und Scann......................................................................46 2.7.2. Das Korrelieren von MRT und Plastinat..........................................46 2.7.3. Das Alignment und die dreidimensionale Visualisierung.................50 3. Ergebnisse.....................................................................................52 3.1. Vorbehandlung................................................................................52 3.1.1. Vorbehandlung fixierten und unfixierten Gewebes..........................52 3.1.2. Die Vorbereitung des Gewebes zur Erzeugung optimaler MRT und CT...........................................55 3.1.3. Die Erzeugung von Gefrierschnitten von fixiertem und unfixierten Gewebe.............................................59 3.1.4. Farbige Injektion und Einbettung.....................................................60 3.2. Untersuchung der Leiche am MRT .................................................61 3.2.1. Das Befestigen des Leichnams zur Untersuchung und zum Transport in das Plastinationslabor ....61 3.2.2. Das Justieren des MRT...................................................................62 3.2.3. Die Markierung der Bezugsebenen.................................................63 3.3. Einfrieren und Sägen.......................................................................64 3.3.1. Die Einwirkung des Vorkühlens auf das Einfrieren .........................64 3.3.2. Die Wirkung des Einfrierprozesses auf das Scheibenplastinat.......66 3.3.3. Das Sägen von Dünnschnitten........................................................67 3.4. Entwässerung und Färbung............................................................69 3.4.1. Die Gewebsschrumpfung im Gefrieraustausch...............................69 3.4.2. Der gestaffelte Gefrieraustausch.....................................................75 3.4.3. Das Entfetten der Körperscheiben..................................................76 3.4.4. Die Einführung histologischer Färbemethoden während des Gefrieraustausches...................................................77 3.5. Imprägnation...................................................................................78 3.5.1 Das Polymerisationsverhalten von Kunststoffflotten.......................78 3.5.2 Die Gewebsschrumpfung während der Kunststoffimprägnation.....79 3.5.3 Das adaptierte Imprägnieren von Körperscheiben mit E12 und FO 127........................................................................81 3.5.4. Das Einbetten der imprägnierten Körperscheiben .................................................81 3.6. Polymerisation.................................................................................81 3.6.1 Härte, Flexibilität und Transparenz von Dünnschnittplastinaten.....82 3.6.2. Das Tempern...................................................................................82 3.6.3. Die Farberhaltung gefärbter Dünnschnittplastinaten.......................83 3.7. Digitalisierung/Korrelation...............................................................83 3.7.1 Fotografie und Scann......................................................................84 3.7.2. Das Korrelieren von MRT und Plastinat..........................................84 3.7.3 Das Alignment und die dreidimensionale Visualisierung.................85 4. Diskussion.....................................................................................86 4.1. Vorbehandlung................................................................................88 4.1.1. Vorbehandlung fixierten und unfixierten Gewebes..........................88 4.1.2. Die Vorbereitung des Gewebes zur Erzeugung optimaler MRT .....91 4.1.3. Die Auswirkung der Vorbehandlung auf die Erzeugung von Gefrierschnitten..........................................94 4.1.4. Farbige Injektionen der Gefäße und farbige Einbettung .................98 4.2. Untersuchung der Leiche am MRT ...............................................100 4.2.1. Die Markierung der Bezugsebenen...............................................100 4.2.2. Das Justierung des MRT...............................................................101 4.2.3. Das Befestigen des Leichnams zur Untersuchung und zum Transport in das Plastinationslabor................................102 4.3. Einfrieren und Sägen.....................................................................103 4.3.1. Die Einwirkung des Vorkühlens auf das Einfrieren .......................103 4.3.2. Die Wirkung des Einfrierprozesses auf das Scheibenplastinat.....104 4.3.3. Das Sägen von Dünnschnitten......................................................105 4.4. Entwässerung und Färbung..........................................................107 4.4.1. Die Gewebsschrumpfung im Gefrieraustausch.............................107 4.4.2. Der gestaffelte Gefrieraustausch...................................................110 4.4.3. Das Entfetten der Körperscheiben................................................111 4.4.4. Die Einführung histologischer Färbemethoden während des Gefrieraustausches.................................................113 4.5. Imprägnation.................................................................................116 4.5.1 Das Polymerisationsverhalten von Kunststoffflotten.....................119 4.5.2 Die Gewebsschrumpfung während der Kunststoffimprägnation...119 4.5.3 Das adaptierte Imprägnieren von Körperscheiben mit Kunststoff.120 4.5.4. Das Einbetten der imprägnierten Körperscheiben ........................121 4.6. Polymerisation...............................................................................121 4.6.1 Härte, Flexibilität und Transparenz von Dünnschnittplastinaten...123 4.6.2. Das Tempern.................................................................................124 4.6.3. Die Farberhaltung gefärbter Dünnschnittplastinaten.....................125 4.7. Digitalisierung/Korrelation.............................................................125 4.7.1 Fotografie und Scann....................................................................126 4.7.2. Das Korrelieren von MRT und Plastinat........................................127 4.7.3 3D- Visualisierung.........................................................................129 5. Zusammenfassung......................................................................135 Literatur.........................................................................................................I URL referring.........................................................................................XIV FTP und CD ...........................................................................................XVI Abbildungsverzeichnis A Tabellen........................................................................................................C Diagramme...................................................................................................D Abkürzungsverzeichnis...............................................................................D Anmerkungen...............................................................................................E Anhang (Liste der Körperspender) ............................................................H 1 1. Einführung 1.1. Stand Ärztliches Können setzt Wissen voraus. Vor allem in der invasiven Medizin ist anatomisches Wissen die Grundlage des besonders des Chirurgen aber auch für den praktisch tätigen Arzt (STRATE et al. 1998). Durch bildgebende Verfahren (BV) wie die Computertomographie (CT), Magnetresonanz Interferometrie oder Magnetresonanztomografie (MRT) und Positronenemmissionstomografie (PET) oder Sonographie werden dem Arzt neue Einblicke in den menschlichen Körper gewährt. Der untersuchende Arzt muß die Anatomie am gegebenen Bild deuten. Deshalb wird wissenschaftlich viel daran gesetzt, mit Hilfe der BV anatomische Strukturen sicher diagnostizieren zu können. Die traditionelle Anatomie mit ihren morphologischen Präparationstechniken wird selten als Forschungsmethode verwendet, um die mit den BV gewonnenen Ergebnisse zu prüfen, wahrscheinlich, weil diese Techniken selten beherrscht werden (s. Anmerkungen: Präparator). Trotzdem scheint die moderne Medizin die klassische Morphologie weiter zu benötigen, wie beispielsweise das „visible human project“ [Online: NLM] verdeutlicht (SPITZER et al. 1996, SPITZER et WHITLOCK 1998), [Online: NLM]. Ähnliche Projekte gibt es in Korea (visible human korean, VHK; CHUNG et KIM 2000; CHUNG et PARK 2003) und in China (chinese visible human, CVH; ZHANG et LEE 2002), [Online: VHK; Online: CVH]. Diese Projekte erarbeiten mehrere Datensätze aus BV mit zugehörigen Bildserien von Schnittflächen eingefrorener Leichen (ACKERMAN 1999). 1400 Arbeitsgruppen in 43 Ländern verarbeiten die Daten des VHP [Stand 1995, ZHANG et al. 2003 [Online: NLM]. Der heutige Forschungsschwerpunkt im Fach Anatomie liegt weniger in der makroskopischen Darstellung vermeintlich altbekannten Wissens am Präparat oder anhand der Ergebnisse moderner BV, als vielmehr im Schaffen neuen Wissens vor allem mit molekularbiologischen Methoden. Dabei wird insbesondere die Substruktur erforscht und die dazu nötige Technik verbessert, was sich in der Masse entsprechender Publikationen zeigt und in dem Mangel an makroskopischen Untersuchungen. 2 Anders als die histologischen, histochemischen, zytologischen und schließlich molekularen Techniken werden die makroskopischen Präparationstechniken zur Darstellung der Schnittanatomie derzeit wenig verbessert, sondern, wenn überhaupt, zumeist unverändert angewandt (s. Anmerkungen: Präparator). Um beispielsweise die Topographie von zweidimensionalen Schnittpräparaten zu zeigen, stellt HYRTL Gefrierschnitte in unterschiedlichen Dicken von Leichnamen her. 1860 präsentierte dieser Autor 1 cm dicke Gefrierschnitte. In jüngerer Zeit stellt man an solcherart Schnitten umfangreiche Untersuchungen an, um MRTs und CTs zu interpretieren, etwa beim „Visible Human Project“ (VHP) [Online: NLM]. 1.2. Ziel vorliegender Arbeit Vorliegende Arbeit dient der Interpretation von CT und MRT anhand anatomischer Präparate anhand von Fallbeispielen, an denen das Vorgehen mit dieser vergleichend- anatomischen Technik in Schritten erläutert wird Mit der anatomischen Technik der Schnittanatomie (HYRTL 1860) verbessern RAUSCHNING unter anderem mit BERGSTROM die vergleichende radiologisch- anatomische Technik, in dem diese und andere Autoren gefrorenes, fixiertes Leichenmaterial radiologisch untersuchen und dieses anschließend einbetten, zersägen und fotografieren (RAUSCHNING 1983; RAUSCHNING et BERGSTRÖM 1983; RAUSCHNING et al. 2003, BASSETT et al., 1991). Der Interpretation von CT und MRT dienen auch die Projekte „VHP“ (1996), „VHK“ und „CVH“ (beide 2003) durchgeführt - also ebenfalls mit der Technik, die HYRTL (1860) und auch BRAUNE (1875, BRAUNE et ZWEIFEL 1890) mehr als hundert Jahre zuvor angewandten. In dieser Arbeit wird gezeigt, mit welcher Technik diese Interpretation genauer erfolgen kann, indem hochauflösende, dünne Plastinate (DSP) sowohl vergleichend zu MRT und CT als auch isoliert als Präparate für Lehr- und Studienzwecke hergestellt werden können. Die Bedeutung anatomischer Untersuchungen von MRT anhand originaler Schnitte stellen MACKENZIE et. al. (1994) fest. Der Autor betont neben dem Nutzen in der ärztlichen Weiterbildung „the investigation of the signal characteristics of the tissues, the validitation of the interpretation of images and the demonstration of the technical capabilities of an imaging sequence“(p.184). 3 Bei dem VHP, dem VHK und CVH fotografiert man die Schnittflächen schrittweise vom eingefrorenen, unfixierten Leichnam in Aufsicht nach der von RAUSCHNING (1983) entwickelten Hobeltechnik (SPITZER et al. 1996; CHUNG et KIM 2000; ZHANG et al. 2003). Die entstandenen digitalen Bilder sind mit denen der vorher eingesetzten BV gut korrelierbar. SPITZER et al. (1996) müssen beim VHP zur Kenntnis nehmen, daß die unter der Schnittfläche liegenden anatomische Strukturen durch das gefrorene Wasser des Gefrierschnittes an dessen Oberfläche hindurch scheinen, wodurch das Bild unscharf wird. Um diesen Effekt zu minimieren, sprühen diese Autoren niedrigmolekulare Alkohole auf den Schnitt. Den dabei beobachteten Effekt eines sich verschärfenden Bildes stellt RUTH bereits 1934 bei der Einbettung in Glyzerin fest, und zwar in Anwendung der SPALTEHOLZschen Erkenntnis der optischen Eigenschaften biologischen Gewebes (1911). Gleichfalls zur Verbesserung der optischen Auflösung montiert WOLFF 1933 unter Erhaltung der Farbe von gefrorenem Gewebe geschnittene Körperscheiben in Sichtrahmen. Aber erst die Einbettung dieser Gefrierschnitte in optisch dichtere Medien verbessert die Auflösung (PIECHOCKI 1986). Wesentlich verbessert wird die optische Auflösung erst durch das Einbetten von Schnitten in optisch dichte Medien (ROMANIAK 1946), vor allem in die durch VON HAGENS 1977 patentierte und ein Jahr darauf von dem selben Autor gemeinsam mit KNEBEL (1978) vorgestellten Plastinationskunststoffe (VON HAGENS 1977, VON HAGENS et KNEBEL 1978). Zur Verbesserung der optischen Auflösung wird deshalb in dieser Arbeit keine Gefrierschnittechnik entwickelt, sondern die Plastination modifiziert. Die Plastination, eine Präparationstechnik, bei der das Gewebswasser durch Kunststoff ersetzt wird, ist durch einen Bereich dieser Technik bekannt geworden: die Silikonplastination (BOHANNON 2003). Für Körperscheiben führt VON HAGENS mit KNEBEL (1978) einen weiteren Kunststoff ein, das Epoxidharz, das einen dem menschlichen Gewebe ähnlichen Lichtbrechungsindex wie das Gewebe aufweist. Plastinierte Körperscheiben werden dadurch transparent und somit optisch höher auflösend als Gefrierschnitte oder Scheiben formalinfixierter oder unfixierter Präparate. Transparente Plastinationsscheiben können entweder durch Plastination von gefriergeschnittenen Köperscheiben erzeugt werden („Scheibenplastination“) oder sie werden von im Voraus plastinierten Proben mit einer Feinsäge abgeschnitten („Block-“ oder „Stückplastination“). 4 Von Blöcken kann sehr dünn abgeschnitten werden (0,2 mm, MATSUMURA et SAITO 1997; HOCH et al. 1999). Da die Haut eine Diffusionsbarriere für Kunststoff darstellt (STEINMANN 1982, PIECHOCKI 1986), kann diese Technik an intakten Leichen oder großen Leichenteilen nicht angewendet werden. Zwar sind die Schnitte von Blockplastinaten anfärbbar. Der Vorgang ist insgesamt aufwendig, denn jeder Schnitt muß einzeln geschliffen und poliert werden (FRITSCH 1988). Damit die vom Block abgesägten Körperscheiben transparent werden, gießt REIZ (2002) sie noch einmal in Kunststoff ein, wie auch HOCH et al. (2004a, 2004b). Trotz des Aufwandes wird die Blockplastination häufiger angewendet als die Scheibenplastination, denn die optische Auflösung ist, bedingt durch die geringe Schnittdicke von etwa 0,2 mm, sehr hoch. Die Scheibenplastination (BRIZZI et al. 1994, JONES 2002) wird in Korrelation zu BV bisher in der Stärke von ca. 3 mm Dicke eingesetzt (BEYERSDORFF et al. 2001). ZHANG.M und LEE erzeugen 2,5 mm dünne Plastinate mit der Scheibenplastination, allerdings ohne BV (2002), weswegen keine Korrelation möglich ist. Wenn in dieser Arbeit gezeigt werden kann, daß man sehr dünne Scheibenplastinate mit radiologischen Abbildungen vergleichen kann, und diese Plastinate eine höhere optische Auflösung als die CTs und MRTs erreichen, ist gewährleistet, daß die radiologischen Schnittbilder mit den Scheibenplastinaten eindeutig diagnostizierbar sind. Für den Kliniker ist die Anwendung der Plastination in Zusammenhang mit den üblichen Untersuchungsmethoden interessant, besonders mit MRT (z.B. ZHANG et al. 2002, THOMAS et al. 2001, 2004), aber auch mit CT (z.B. QIU et al. 2004a; SORA et al. 2002a) oder mit Sonographie (z.B. BRÖKELMANN 1989, ECKSTEIN 1994). Dabei sind diese Untersuchungen entweder korrelierend (dasselbe, identische Plastinat wird vergleichend radiologisch untersucht), oder korrespondierend (ein gleiches, ähnliches Plastinat wird vergleichend untersucht), wobei diese Begriffe unscharf verwendet werden. Da durch den medizintechnischen Fortschritt in den radiologischen BV die Abbildungen in immer höherer Qualität vorliegen, sollte es möglich sein, eine korrelierende Körperscheibe so dünn herzustellen, daß qualitativ gleichwertige oder hochwertigere Plastinationsbilder dem klinisch korrelierendem Bild zugeordnet werden können. Ist der Schnitt sehr dünn, sollte das Gewebe gefärbt werden, weil die körpereigenen Pigmente zur Differenzierung an einem dünnen Schnitt unzureichend sind (STEINKE 2001, STEINKE et al. 2002).