AVERTISSEMENT Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : [email protected] LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE Laboratoire des Sciences du Génie Chimique - Nancy - CNRS l_MlJ\99Q. JI.. C~E\/ALOt THE SE présentée à l'INPL par Isabelle CHEV ALOT pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLY'PECHNIQUEi-:1rJE' 1'lORRAINE Spécialité: Génie des Procédés Sujet: Production d'une protéine membranaire humaine par cultures en réacteurs de cellules animales recombinantes Obtention de la lignée CHO recombinante et études cinétiques en réacteurs discontinus et semi-continus Soutenue publiquement le 17 Décembre 1992 devant la commission d'examen: Membres du jury: Président: M J.M. ENGASSER Examinateurs : Mme A. MARC Rapporteurs: MM O. MERTEN MM R. COUDERC G. SIEST J. STRACZECK M.KOEHL Avant-propos Ce travail a été réalisé au Laboratoire des Sciences du Génie chimique de Nancy, au sein du groupe Génie des Procédés Biotechnologiques sous la direction de Madame Annie MARC, Directeur de Recherche au CNRS. Je la remercie pour l'intérêt qu'elle a témoigné à ce travail et d'avoir accepté de faire partie de ce Jury. Cette thèse est le fruit d'une collaboration avec le Centre du Médicament, dirigé par Monsieur le Professeur Gérard SIEST et le Laboratoire de Biochimie de la Faculté de Nancy, dirigé par Monsieur le Professeur Pierre NABET. A ce titre, je les remercie de m'avoir accueillie dans leur laboratoire. Je remercie également Monsieur Gérard SIEST d'avoir accepté d'être le rapporteur de ce Jury de thèse. J'exprime ma vive reconnaissance à Monsieur Jean-Marc ENGASSER, Professeur à l'I.N.P.L., de m'avoir permis de réaliser ce travail et d'avoir accepté la présidence de ce jury. Je tiens également à remercier Monsieur MERTEN, Chargé de Recherche à l'Institut Pasteur de Paris, d'avoir bien voulu juger ce.travail en tant que rapporteur du Jury. Ma reconnaissance va également à Messieurs René COUDERC, responsable du département de cultures de cellules à Sanofi-Elf-Bio-Recherche à Toulouse, Jean STRACZECK, Maitre de Conférence et Praticien Hospitalier à Nancy et Michel KOEHL, responsable du Service Développement de Transgène à Strasbourg, d'avoir accepté d'examiner mon travail et de se joindre à ce Jury. Je remercie tout particulièrement les personnes qui m'ont aidée dans mon travail dans les différents laboratoires où j'ai travaillé. Je n'oublierai pas les petits plats mitonnés par Tchouf, pendant les soirs de rédaction et la présence de mon petit Quentin qui a été mon moteur ces deux dernières années. ABREVIATIONS a a : Acides aminés ADN : Acide désoxyribonucléique A la :Alanine Arg : Arginine ARN : Acide ribonucléique BSA : Albumine sérique bovine CHO : Chinese Hamster Ovary DEAE : Diéthyl aminoéthyle DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO : Diméthyl sulfoxide EDTA : Acide éthylène diamine tétra-acétique GGT : Gamma-glutamyl transférase Glc :Glucose Gin : Glutamine Glu :Glutamate GluCNA : L-Gamma-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide Gly :Glycine Glygly : Glycylglycine Ham Fl2 : Mélange nutritif de Ham His :Histidine Lac :Lactate LDH : Lactate déshydrogénase NH4 :Ions ammonium" PBS : "Phosphate buffered salt Pro : Proline SDS : Dodécylsulfate de sodium Ser : Sérine SVF : Sérum de veau fœtal TMAE : Triméthy aminoéthyle Tris : Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane D :Taux de dilution (h-1) ~s : Vitesse spécifique de consommation de substratS (lQ-lOmmole 1c ellule.h) 7tp :Vitesse spécifique de production de métabolites P (lQ-lOmmole 1c ellule.h) ~ (glob)S : Vitesse spécifique globale de consommation de substrat S : (1 Q-10mmole 1c ellule.h) 7t(glob)p : Vitesse spécifique globale de production de métabolites P : ( 1Q -lûmmole 1c ellule.h) Jlapp :Vitesse spécifique apparente de prolifération cellulaire (h-1) J.Lréel : Vitesse spécifique réelle de prolifération cellulaire (h-1) : Vitesse spécifique globale de prolifération cellulaire (h-1) J.Lglob kd : Vitesse spécifique de décès cellulaire (h-1) Xv : Cellules vivantes Xb : Cellules susceptibles d'intégrer le bleu Trypan X rn : Cellules mortes (bleues+ lysées) Xl : Cellules lysées X tot : Cellules totales kb :Kilo bases kDa :Kilo daltons PLAN GENERAL INTRODUCTION GENERALE ••.••••.••••••••••..••••.••.•.•••..••.••• 1 Situation actuelle des biotechnologies .......................................1 Situation du sujet et objectifs ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6 BIBLIOGRAPHIE ....................................................... 9 A. Le génie génétique ............................................................9 B. Production de protéines recombinantes par culture en masse de cellules animales ............................................................... 3 6 C. La gamma-glutamyltransférase •••••••••••••••••••••••••••••••••• S 4 MATERIELS ET METHODES ......................................... 62 A. Génie génétique .............................................................6 2 B. Culture cellulaire .................••......•.....•..••..••..•..•.7 7 C. Caractérisation et pré-purification de protéines recombinantes ................................................................................... 101 RESULTATS: CHAPITRE 1: 1.1. Avant propos ............................................................. 107 I.2. Production d'une enzyme membranaire humaine par des cellules de mammifères recombinantes cultivées en réacteur sur microporteurs .................................................................. 109 1.3. Annexes ................................................................... l36 1.4. Conclusion du chapitre 1. .............................................. 158 CHAPITRE II: Influence des conditions de culture sur le comportement des cellules CHO-GGT II.l. Introduction ............................................................. 15 9 11.2. Influence de l'adhérence des cellules sur des cultures en flacons agités ........................................................................... 161 11.3. Cinétiques de cultures de cellules CHO-GGT en réacteurs discontinu et semi continu .................................................. l80 II.4. Conclusion du chapitre II ..................•.•.•.•....•.••••••....•... 207 CHAPITRE III: Optimisation de la production en masse de la protéine recombinante en vue de son extraction. 111.1. Introduction ............................................................ 209 111.2. Influence de l'ajout d'un agent chimique sur la production et les caractéristiques de l'enzyme recombinante •••...•.•...••••.••.•••.... 211 III.3. Production de GGT humaine par culture en masse de cellules CH 0-GGT avec induction par le butyrate de sodium ......••.•...•..... 2 21 Ill.4. Pré-purification de la GGT humaine produite par culture de cellules CHO-GGT sur microporteurs ....•••••••..••.......•.••......•.... 234 111.5. Conclusion du chapitre 111 ..•..•.••...............•.•••••..•.•.....•. 23 9 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES •...••....•.•... 240 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES •••.•...........••..•.•.••..• 24 7 'LNTRODU.CT'LON B:EN$RÂL:E