PRODUCTION AND PURIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODY TO JAPANESE ENCEPHALITIS VACCINE FROM HYBRIDOMA By Nuttapat Pisuttinusart A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree Master of Science Program in Pharmaceutical Sciences Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2014 Copyright of Graduate School, Silpakorn University PRODUCTION AND PURIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODY TO JAPANESE ENCEPHALITIS VACCINE FROM HYBRIDOMA By Nuttapat Pisuttinusart A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree Master of Science Program in Pharmaceutical Sciences Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2014 Copyright of Graduate School, Silpakorn University การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีตอวัคซีนไขสมองอักเสบเจอีจากไฮบริโดมาและการทําใหบริสุทธ ิ์ โดย นายณัฐพัฒน  พิศูทธินุศาสตร วิทยานิพนธนี้เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาวิทยาการทางเภสัชศาสตร  บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ปการศึกษา 2557 ลิขสิทธิ์ของบัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร The Graduate School, Silpakorn University has approved and accredited the thesis title of “ Production and Purification of Monoclonal Antibody to Japanese Encephalitis Vaccine from Hybridoma” submitted by Mr.Nuttapat Pisuttinusart as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Pharmaceutical Sciences. ............................................................................ (Assistant Professor Panjai Tantatsanawong,Ph.D.) Dean of Graduate School …........./............/.......... The Thesis Advisor Assistant Professor Wisit Tangkeangsirisin, Ph.D. The Thesis Examination Committee .................................................... Chairman (Assistant Professor Siripan Limsirichaikul, Ph.D.) ............/.............../............. .................................................... Member (Boontarika Boonyapiwat, Ph.D.) ............/.............../............. .................................................... Member (Lawan Siangjong, Ph.D.) ............/.............../............. .................................................... Member (Assistant Professor Wisit Tangkeangsirisin, Ph.D.) ............/.............../............. 55361202 : MAJOR : PHARMACEUTICAL SCIENCES KEYWORD : JAPANESE ENCEPHALITIS VACCINE / MONOCLONAL ANTIBODY / HYBRIDOMA NUTTAPAT PISUTTINUSART : PRODUCTION AND PURIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODY TO JAPANESE ENCEPHALITIS VACCINE FROM HYBRIDOMA. THESIS ADVISOR : ASST.PROF. WISIT TANGKEANGSIRISIN, PH.D. 82 pp. Hybridoma cell is a hybrid cell, which is produced by fusion of an antibody producing cell with a tumor cell. It has been used to produce large quantity of monoclonal antibody that is specific to its antigen. Monoclonal antibody has been applied in many areas of biological, therapeutic and medical researches. Nowadays, several techniques for identification and quantification of biomolecules are based on immunoassay. Monoclonal antibody is often used for these purposes. The objective of this study is to produce, purify, characterize and conjugate a monoclonal antibody specific to Japanese Encephalitis (JE) vaccine from the hybridoma cultured medium. The growth and antibody production effect of Chemically Defined medium (CD medium) has been compared to RPMI supplemented with 5% serum medium (Serum containing medium). Serum medium gave a better antibody concentration than CD medium. Due to the disadvantages of serum medium, CD medium was used for large scale production. Monoclonal antibody was successfully produced by growing the hybridoma cells in CD medium and purified by protein G chromatography. SDS-PAGE was used to characterize molecular weight and purity of the purified antibody. The molecular weight of purified antibody was accurately compared to theory and the purity is about 98%. The in vitro binding analysis was characterized by dot blot and enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) techniques. The results presented that purified antibody can bind to JE vaccine in both native and reduced forms but not denatured form. Afterwards, the purified antibody was conjugated to horseradish peroxidase enzyme. The effect of factors such as pH and molar ratio has been studied. High pH (pH 9.4) and molar ratio of enzyme to antibody (8:1) were the most optimal conditions. The efficiency of conjugated antibody were determined by direct ELISA. The conjugated antibody can detect the JE vaccine in a range of dilution 1:200 to 1:12800. In conclusion, native antibody and conjugated antibody was successfully prepared and could be potentially applied for quality control during the JE vaccine manufacturing processes. Program of Pharmaceutical Sciences Graduate School, Silpakorn University Student's signature..........................................................................Academic Year 2014 Thesis Advisor's signature ............................................................................................... d 55361202 : สาขาวิชาวิทยาการทางเภสัชศาสตร  คําสําคัญ : วัคซีนไขสมองอักเสบเจอ/ีโมโนโคลนอลแอนติบอด/ีไฮบริโดมา ณัฐพัฒน พิศูทธ ินุศาสตร : การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีตอวัคซีนไขสมอง อักเสบเจอีจากไฮบริโดมาและการทําใหบริสุทธ.ิ์ อาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ : ภก.ผศ.ดร.วิสิฐ ตั้งเคียงศิริสิน. 82 หนา. ไฮบริโดมาเซลลเปนเซลลที่เกิดจากการหลอมรวมกันระหวางเซลลที่ผลิตแอนติบอดีและ เซลลมะเร็ง ซึ่งเซลลที่รวมกันนั้นจะมีความสามารถที่จะผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จําเพาะตอ แอนติเจนได โมโนโคลนอลแอนติบอดีไดถูกใชอยางกวางขวางในงานวิจัยดานชีววิทยา การรักษา โรคและการแพทย ในปจจุบันเทคนิคที่ใชในการตรวจและระบุสารชีวโมเลกุลอาศัยหลักการ ทางอิมมูโนวิทยา โมโนโคนอลแอนติบอดีถูกใชอยางแพรหลาย ในงานวิจัยฉบับนี้ไดมีการผลิต, แยกบริสุทธ,ิ์ วิเคราะหคุณสมบัติและเชื่อมตอโมโนโคลนอลแอนติบอดีจําเพาะตอวัคซีนไขสมอง อักเสบจากน้ําเลี้ยงเซลลไฮบริโดมา ในงานวิจัยไดมีการเปรียบเทียบผลของอาหารสองชนิดคือ Chemically defined medium (CD medium) และ RPMI +5% serum ตอการเจริญและการผลิต แอนติบอดี ผลการศึกษาพบวา เซลลที่เลี้ยงในอาหาร RPMI ใหปริมาณแอนติบอดีมากกวา อาหาร CD แตเนื่องดวยขอจํากัดของอาหาร RPMI จึงไดใชอาหาร CD ในกระบวนการผลิตแอนติบอดีแทน แอนติบอดีที่เตรียมไดถูกแยกใหบริสุทธิ์โดยใชเทคนิค Protein G โครมาโตกราฟ ผลจาก SDS-PAGE แสดงใหเห็นวาแอนติบอดีมีความบริสุทธิ์ถึง 98 เปอรเซน็ ตและมีขนาดตรงตามทฤษฏี ผลการศึกษาการจับกันอยางจําเพาะตอวัคซีนหลายรูปแบบ พบวา แอนติบอดีสามารถจับกับวัคซีน ในรูปแบบปกติและรีดิวซเทานั้น แอนติบอดีที่เตรียมไดถูกนํามาเชื่อมตอกับเอนไซม horseradish peroxidase ดวยสภาวะที่เหมาะสม เมื่อทําการศึกษาผลของ pH และ ความเขมขนของเอนไซมที่ใช ในการเชื่อมตอ พบวาที่สภาวะ pH สูง (pH 9.4) และความเขมขนของเอนไซมตอแอนติบอดีที่สูง (8:1) สงผลตอประสิทธิภาพของแอนติบอดีที่เชื่อมตอกับเอนไซม ซึ่งแอนติบอดีที่เชื่อมตอแลว สามารถนํามาประยุกตใชในการตรวจหาปริมาณแอนติเจนในวัคซีนความเขมขน 1:200-1:12800 ได โดยสรุปแลวงานวิจัยนี้ผูวิจัยสามารถเตรียมทั้งแอนติบอดีและแอนติบอดีที่เชื่อมตอกับเอนไซมได สําเร็จและสามารถที่จะนําไปประยุกตใชกับงานควบคุมคุณภาพระหวางกระบวนการผลิตวัคซีนเจอ ี วิทยาการทางเภสัชศาสตร บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ลายมือชื่อนักศึกษา...................................................................................................ปการศึกษา 2557 ลายมือชื่ออาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ............................................................................................... e Acknowledgement I would like to thank to my thesis advisor, Assistant Professor Dr. Wisit Tangkeangsirisin, who has devoted his time to help me throughout my M.Sc. with support, guidance and his assistance. There are many things that I learned from him. I would also like to thank Dr. Boontarika Boonyapiwat , Dr. Lawan Siangjong and Asst Prof Dr. Siripan Limsirichaikul and for their supervision and valuable comments on this thesis. I am thankful that in their activity, they accepeted to be members of the reading committee. Special thanks to my friends, Ms. Maliwan Kamkeaw, Ms. Arpon Keawprathana, Ms. Piyaporn Wong-Akson, Ms. Kornsima Chayansupap and Ms. Kamonrak Cheewatanakornkool and other friends from the judo club who I do not mention here. They have not only provided a friendship and courage, but also their moral support for me, too. I always keep that in mind. This thesis is partially supported by Faculty of Pharmacy, Silpakorn University and Graduated School, Silpakorn Univercity for their financial support. Finally, I would like to thank my beloved family for their wishes. f Contents Page English Abstract d Thai Abstract e Acknowledgement f Contents g List of Figures h List of Table i Chapter 1 Introduction 1 2 Literature Reviews 5 3 Materials and Methods 27 4 Results 39 5 Disscussion 59 Reference 63 List of Abbreviation 70 Appendix 71 Biography 82 g List of Figures Page 1. Conceptual framework of this study 4 2. Schematic diagram of Japanese encephalitis virus genome and polyprotein organization 7 3. Transmission cycle of Japanese encephalitis virus 8 4. The schematic of ELISA 14 5. The schematic of competitive ELISA 15 6. Structure of IgG antibody 17 7. The schematic of hybridoma technology for monoclonal antibody 19 8. The reaction scheme of oxidizing vincinyl diol with periodic acid treatment26 9. The reaction scheme of reductive amination 26 10. Antibody concentration of each selected clone 39 11. Cell morphology of S10 cells 40 12. Growth and viability of S10 in different medium 42 13. Antibody concentration of S10 in different medium 44 14. Growth and viability of S10 in different initial cell number 45 15. Antibody concentration of S10 in different initial cell number 46 16. Schematic and flow chart in monoclonal antibody purification step 47 17. ELISA analysis of the each purification 50 18. SDS-PAGE of fractions from purification process 51 19. Reduced SDS-PAGE of purified IgG 55 20. Dot blot analysis 55 21. A comprehensive analysis of the binding of purified antibody to different forms of vaccine 56 22. Effect of pH on enzyme conjugation 58 23. Effect of molar ratio on enzyme conjugation 59 h List of Tables Page 1. Comparison of Direct, Indirect, Sandwich and Competitive ELISA Methods13 2. Comparison of advantage and disadvantage between two approaches for antibody production 21 3. Purification profile of IgG 52 4. The overall of results in this study 64 i