UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA Presencia de los Virus de la Enfermedad de Marek y Anemia Infecciosa Aviar en aves de levante del norte y oriente del departamento de Antioquia Propuesta de trabajo de grado para el título de Maestría en Ciencias Veterinarias, línea de investigación en enfermedades infecciosas. FCA. UdeA Sara López Osorio (i) 6/12/2015 Comité tutorial: Jenny Jovanna Chaparro MV. MSc. Dr.Sc Diego Piedrahita MVZ. MSc. PhD. Gloria Consuelo Ramírez Nieto. MV. MSc. PhD. ⁱMedica Veterinaria. ©MsC. Grupo de Investigación CENTAURO. Tabla de contenido 1.1 Título ............................................................................................................... 10 1.2 Identificación del Estudiante ........................................................................ 10 1.3 Comité tutorial ................................................................................................ 10 1.4 Grupo de investigación ................................................................................. 10 1.5 Categoría del grupo de investigación ........................................................ 10 1.6 Duración de la propuesta ............................................................................. 10 1.7 Valor Total de la Propuesta ......................................................................... 10 1.8 Fuentes de financiación: .............................................................................. 10 1. Prefacio ...................................................................................................... 11 2. Agradecimientos ........................................................................................ 16 3. Resumen ................................................................................................... 16 4. Summary. .................................................................................................. 17 5. Introducción general .................................................................................. 18 6. Objetivos .................................................................................................... 21 a. Objetivo general ............................................................................................ 21 b. Objetivos específicos .................................................................................... 21 Capítulo 1: Marco teórico ................................................................................. 22 1.1 Anemia Infecciosa Aviar (CIAV): Revisión .................................................... 22 1.1.1 Introducción ...................................................................................... 22 1.1.2 Características del virus. ................................................................... 24 1.1.3 Transmisión del CIAV ....................................................................... 26 1.1.4 Patogénesis ...................................................................................... 27 1.1.5 Signos clínicos .................................................................................. 31 1.1.6 Diagnóstico ....................................................................................... 33 1.1.7 Epidemiología. .................................................................................. 36 1.1.8 Coinfección ....................................................................................... 38 1.2 Virus de la Enfermedad de Marek .................................................................. 40 1.2.1 Introducción ...................................................................................... 40 1.2.2 Características del MDV ................................................................... 41 1.2.3 Transmisión ...................................................................................... 44 1.2.4 Patogénesis ...................................................................................... 46 Fase 1: Citolítica temprana. ....................................................................... 46 Fase 2: Latencia ..................................................................................... 47 Fase 3: Infección productiva-restrictiva...................................................... 47 Fase 4: Oncogénesis ................................................................................. 48 1.2.5 Signos clínicos .................................................................................. 50 1.2.6 Diagnóstico ....................................................................................... 52 1.2.7 Epidemiología ................................................................................... 58 1.2.8 Vacunación. ...................................................................................... 58 Capítulo 2: Muestreo y preparación de las muestras. ...................................... 61 2.1 Introducción ......................................................................................... 61 2.2 Metodología ......................................................................................... 62 2.2.1 Zona de estudio .............................................................................................. 62 2.2.2 Población y tamaño de muestra .................................................................. 62 2.2.3 Cálculo del tamaño de la muestra ............................................................... 64 2.2.4 Toma de muestra ........................................................................................... 65 2.2.5 Extracción de DNA. ........................................................................................ 66 2.2.6 Condiciones PCR estándar para gen de referencia ................................. 67 2.2.7 Electroforesis .................................................................................................. 67 2.2.8 Preparación del BSA ..................................................................................... 68 2.3. Resultados .......................................................................................... 68 2.3.1 Cantidad de DNA de las muestras .............................................................. 68 2.3.2 Calidad de DNA de las muestras. ............................................................... 68 2.4 Discusión. ............................................................................................ 69 2.5 Conclusiones. ...................................................................................... 70 Capítulo 3: Estandarización de cultivos Primarios de Embrión de Pollo. ......... 71 3.1 Introducción ........................................................................................................ 71 3.2 Metodología ........................................................................................................ 72 3.2.1 Cultivo primario de fibroblastos de embrión de pollo. ....................... 72 3.2.2 Cultivo primario de riñón, hígado y bursa de embrión de pollo. ....... 73 3.2.3 Descripción morfológica .................................................................... 73 3.3 Resultados y discusión. .................................................................................... 74 a. Fibroblasto de embrión de pollo (FEB) ................................................ 74 b. Células de riñón de embrión de pollo. ................................................. 75 c. Células de Hígado de embrión de pollo. ............................................. 77 d. Células de Bursa de embrión de pollo................................................. 77 3.4 Conclusiones ...................................................................................................... 78 3.5 Agradecimientos ................................................................................................ 79 Capítulo 4: Caracterización molecular del Virus de la Enfermedad de Marek en muestras de sangre y pluma de aves de levante de postura comercial en Colombia. ......................................................................................................... 80 4.1 Introducción ........................................................................................................ 80 4.2 Metodología ........................................................................................................ 82 4.2.1 Material biológico .............................................................................. 82 a. Virus. ...................................................................................................... 82 b. Estándares de DNA (FEP) ..................................................................... 82 4.2.2 PCR convencional ........................................................................ 82 a. Serotipo 3 (MeHV-1) ........................................................................... 82 b. Serotipo 2 (GaHV-3)............................................................................ 83 c. Serotipo 1 (GaHV-2)............................................................................ 83 4.2.3 Electroforesis .................................................................................... 85 4.2.4 Extracción y purificación de producto de PCR a partir de gel de Agarosa ..................................................................................................... 85 4.2.5 Secuenciación .................................................................................. 85 4.2.6 Ensamblaje ....................................................................................... 86 4.2.7 PCR en tiempo real (rtPCR) ............................................................. 86 a. Extracción de DNA a partir de tarjetas FTA. .......................................... 87 b. Control endógeno de la rtPCR: .............................................................. 87 c. Iniciadores .............................................................................................. 88 d. Condiciones rtPCR ................................................................................ 89 e. Análisis ................................................................................................ 89 4.2.8 Intento de aislamiento. ...................................................................... 90 a. Preparación del inóculo. ........................................................................ 90 b. Inoculación en cultivo primario ............................................................ 91 4.3 Resultados .......................................................................................................... 91 4.3.1 El MDV circula en sangre durante todo el levante. ........................... 91 4.3.2 El MDV es eliminado en pluma en mayor cantidad a los 30 días. .... 95 4.3.3. EL número de bandas en la PCR del segmento BAMH sugiere que en las granjas circulan varias cepas. ......................................................... 98 4.3.4 Mutaciones en el gen Meq sugieren que se tratan de cepas atenuadas de GaHV-2 ............................................................................. 100 4.3.5 Efecto citopático en FEP compatible con GaHV-2 .......................... 104 4.3 Discusión ...................................................................................................... 105 4.4 Conclusiones. ................................................................................................... 110 Capítulo 5: Presencia del virus de la anemia infecciosa aviar determinada mediante PCR y su caracterización molecular por RFLP en aves de postura de algunas granjas del norte y oriente del departamento de Antioquia. .............. 111 5.1 Introducción ...................................................................................................... 111 5.2 Metodología ...................................................................................................... 112 5.2.1 Material biológico ............................................................................ 112 Virus......................................................................................................... 113 5.2.2 Extracción de DNA. ......................................................................... 113 5.2.3 PCR convencional .......................................................................... 113 5.2.4 Análisis por endonucleasas de restricción ...................................... 114 5.3 Resultados ........................................................................................................ 114 5.3.1 Presencia del CIAV en las granjas evaluadas durante su etapa de levante ..................................................................................................... 114 5.3.2 Estandarización de la RFLP con cepa control ................................ 116 5.3.3 Coinfección con el Virus de la enfermedad de Marek. .................... 117 5.4 Discusión .......................................................................................................... 117 5.5 Perspectivas ..................................................................................................... 119 Capítulo 6: Publicación en Revista Plumazos # 51. 2015. AMEVEA Colombia. ....................................................................................................................... 121 La inmunodepresión subclínica- Un problema importante en los sistemas de producción avícola ......................................................................................... 121 6.1 Introducción ...................................................................................................... 122 6.2 Metodología ...................................................................................................... 125 a. Población y tamaño de muestra ........................................................ 125 b. Muestreo ........................................................................................... 126 c. Histopatología ................................................................................... 126 6.3 Resultados y discusión ................................................................................... 127 6.3.3 Hallazgos histopatológicos en tejido de timo .................................. 132 6.4 Conclusiones .................................................................................................... 134 Capítulo 7: Characterization of Marek´s Disease Virus in a layer farm from Colombia. ....................................................................................................... 137 7.1 Summary. .......................................................................................................... 137 7.2 Resumen ........................................................................................................... 138 7.3 Introduction ....................................................................................................... 140 7.4 Materials and methods ................................................................................... 142 7.4.1 Sample collection. ........................................................................... 142 7.4.2 Histopathology and immunohistochemistry. .................................... 142 7.4.3 DNA extraction. ............................................................................... 143 7.4.4 PCR amplification of MDV genes. ................................................... 144 7.4.5 Pathotype analysis by PCR. ........................................................... 146 7.4.6 Sequencing and phylogenetic analysis. .......................................... 146 7.4.7 Real - Time PCR. ............................................................................ 146 7.4.8 Viral Isolation. ................................................................................. 147 7.5 Results .............................................................................................................. 148 7.5.1 The histopathological lesions are compatible with Marek´s Disease. ................................................................................................................. 149 7.5.2 Genomic amplification of the 3 serotypes of MDV. ......................... 151 7.5.3 The GaHV-2 strain is highly virulent according to its repeating pattern of 132 bp. ................................................................................................. 154 7.5.4 Meq gene mutations confirm the presence of a highly virulent strain (vv+MDV). ................................................................................................ 154 7.5.5 The UdeA-2013CO was clustered with vv+ MDV strains. ............... 156 7.5.6 The cytophatic effect in cell culture is characteristic of MDV GaHV-2. ................................................................................................................. 158 7.6 Discussion ........................................................................................................ 158 9. References ................................................................................................. 167 Índice de tablas Tabla 1: Información de las granjas muestreadas ............................................ 65 Tabla 2: Iniciadores para gen de Referencia. ................................................... 67 Tabla 3: Panel de imágenes de FEP. ............................................................... 75 Tabla 4: Panel de imágenes de Células de embrión de pollo........................... 76 Tabla 5: Resumen de iniciadores para PCR de MDV. ..................................... 84 Tabla 6: Iniciadores y sondas utilizados en la rtPCR y PCR ........................... 88 Tabla 7: Promedio de cuantificación del MDV en sangre ................................. 92 Tabla 8. Panel de Gráficas con la Curva estándar de la q PCR de GaHV-2 (MDV1 Meq gene), GaHV-3 (MDV2 SB1), MeHV-1 (HVT sORF 1) y Ovo gene. ......................................................................................................................... 94 Tabla 9: Cuantificación del MDV en pool de pluma .......................................... 96 Tabla 10: Cepas con porcentaje de identidad para las muestras secuenciadas. ....................................................................................................................... 100 Tabla 11: Alineación de secuencia de aminoácidos deducidos de la proteína Meq. ............................................................................................................... 101 Tabla 12. Panel de Imágenes de FEP inoculadas con muestras de bazo. .... 104 Tabla 13: Grado de lesión a nivel microscópico en la bursa de Fabricio ........ 131 Tabla 14 Primers for PCR and rtPCR detection of the three MDV serotypes. 145 Tabla 15. Histological findings in birds with clinical signs of Marek's Disease.150 Tabla 16 Comparative results between standard PCR and rtPCR. ................ 153 Tabla 17. Amino acid substitution in the Meq protein of GaHV-2 strains. ....... 155 Índice de imágenes Imagen 1: Electroforesis del producto de PCR H3 y H8 (Gen de referencia) de algunas de las muestras. ................................................................................. 69 Imagen 2: Productos de amplificación de la PCR 132 pb. Control positivo cepa Rispens (8 repeticiones).. ................................................................................. 99 Imagen 3: Gel Agarosa 1%. Productos de amplificación de la PCR 132 pb.. .. 99 Imagen 4: PCR para VP2.. ............................................................................. 115 Imagen 5: Digestión del control positivo con 6 enzimas ................................. 116 Imagen 6: Corte histológico de Bazo. ............................................................. 129 Imagen 7: Corte histológico de Bursa de Fabricio.. ........................................ 132 Imagen 8: corte histológico de Timo.. ............................................................. 134 Image 9. Lymphoid infiltrate in sciatic nerve of a bird with clinical signs of MDV in different magnification. ............................................................................... 150 Image 10. A. Section of thymus from a laying hen with clinical signs of MDV from Colombia.. .............................................................................................. 151 Image 11. PCR amplification of the Meq gene from MDV clinical case of this study.. ............................................................................................................. 152 Image 12. Phylogenetic relationships between 41 GaHV-2 strains based on Meq gene sequences. .................................................................................... 157 Image 13. Virus isolation in chicken embryo fibroblast.. ................................. 158 Índice de Gráficas Gráfica 1: Curva de crecimiento FEB. .................................................................... 74 Gráfica 2: Curva de Crecimiento para células de Hígado, Bursa y Riñón de embrión de pollo.. ........................................................................................................ 78 Gráfica 3: Resultados por PCR para MDV MeHV-1 (serotipo 3), GaHV-2 (Serotipo 1) y GaHV-3 (serotipo 2) en sangre en las diferentes edades. ........... 92 Gráfica 4: Resultados de rtPCR para GaHV-2 (Meq Gen) y MeHV-1 en muestras de sangre ..................................................................................................... 95 Gráfica 5: Resultados por PCR para MDV MeHV-1 (serotipo 3), GaHV-2 (Serotipo 1) y GaHV-3 (serotipo 2) en pooles pluma en las diferentes edades. 96 Gráfica 6: Resultados de rtPCR para GaHV-2 (Meq Gen) y MeHV-1 en muestras de pluma ...................................................................................................... 97 Gráfica 7: Resultados de rtPCR para GaHV-3 (DNA pol gen) en muestras de pool de pluma ............................................................................................................... 98 Gráfica 8: Dinámica de positividad por PCR para CIAV. BY: aves de traspatio. ...................................................................................................................................... 115 Gráfica 9: Porcentaje global de Positividad para gen VP2 (A) y VP1 (B) en las muestras de sangre. .................................................................................................. 116 Gráfica 10. Porcentaje de coinfección con CIAV y MDV (GaHV-2). ................. 117 Gráfica 11: Porcentaje de tejido (bazo) con clasificación histopatológica en escala nominal durante la etapa de levante. ......................................................... 128 Gráfica 12: Porcentaje de tejido (bursa) con clasificación histopatológica en escala nominal durante la etapa de levante. ......................................................... 130 Gráfica 13: Porcentaje de tejido (timo) con clasificación histopatológica en escala nominal durante la etapa de levante. ......................................................... 133 Índice de ilustraciones Ilustración 1: Estructura del virion del género Gyrovirus. ................................. 24 Ilustración 2: Sitios de corte y fragmentos generados por enzimas de restricción en VP1. ............................................................................................................ 36 Ilustración 3: Estructura del virión género Mardivirus. ...................................... 42 Ilustración 4: Esquema de evolución del MDV. ................................................ 44 Ilustración 5. Árbol Filogenético para cepas MDV. ......................................... 103 Ilustración 6: Causas de inmunosupresión en aves. ...................................... 124