动 物 学 研 究 2012,Aug.33(4):402−408 CN53-1040/Q ISSN0254-5853 ZoologicalResearch DOI:10.3724/SP.J.1141.2012.04402 水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因 外显子 1 多态性分析 苗永旺1,#,*, 哈 福1,# , 高华山1, 袁 峰1, 李大林2, 袁跃云2 (1. 云南农业大学 动物科学技术学院分子遗传学实验室, 云南 昆明 650201; 2. 云南省家畜改良工作站, 云南 昆明 650225) 摘要: 为了揭示牛科物种INHA基因的遗传特征, 该文采用PCR产物直接测序法对水牛、大额牛和牦牛INHA 基因外显子1及其侧翼序列进行多态性检测, 并结合已发表的包括牛科物种在内的一些哺乳动物数据进行了比较 分析。结果表明, 在水牛INHA基因外显子1中存在c.73C>A替换, 为同义替换, 河流型和沼泽型水牛编码产物一 致; 在大额牛的INHA基因外显子1中发现c.62C>T、c.187G>A替换, 分别引起INHA中氨基酸发生p.P21L、p. V63M改变, 两者均为相同性质氨基酸的替换; 在牦牛中发现c.62C>T、c.129A>G替换, 前者也引起编码氨基酸 发生p.P21L替换, 后者为同义替换。在INHA基因5'侧翼区所测出的序列中, 水牛、大额牛和牦牛等物种内均未 发现SNP位点, 但在种间发现存在c.-6T>G的替换, 大额牛、牦牛和普通牛均为c.-6G, 而水牛为c.-6T。在INHA 基因内含子中, 水牛的第31~36位核苷酸处发现有6个碱基的缺失, 即c.262+31_262+36delTCTGAC; 该位点在河 流型水牛中野生型(+/+)占主体, 而在沼泽型水牛中则缺失型(-/-)占主体。在大额牛、牦牛和普通牛等其它牛科物 种的内含子中均未发现该缺失, 但与水牛相比, 大额牛、牦牛和普通牛内含子中发现缺失c.262+78_262+79delTG。 序列比对显示, INHA基因外显子1序列中c.43A和c.67G为水牛中所特有, 而c.173A和c.255G 为大额牛、 牦牛和普通牛所共有,c.24C、c.47G、c.174T和c.206T为山羊所特有。大额牛、牦牛和普通牛间INHA基因外 显子1序列差异较小, 而山羊和水牛与它们间的差异相对较大。 关键词: 水牛; 大额牛; 牦牛; 抑制素α亚基基因（INHA）外显子1; 多态性 中图分类号:S823.8；Q75 文献标志码:A 文章编号:0254-5853-(2012)04-0402-07 Polymorphisms of inhibin α gene exon 1 in buffalo (Bubalus bubalis), gayal (Bos frontalis) and yak (Bos grunniens) MIAOYong-Wang1,#,*,HAFu1,#,GAO Hua-Shan1,YUAN Feng,LIDa-Lin2,YUANYue-Yun2 (1.FacultyofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming 650201,China; 2.DomesticAnimalBreedingandCrossbreed-improvementStationofYunnanProvince,Kunming 650225,China) Abstract:ToelucidatethegeneticcharacteristicsofthebovineInhibinαsubunit(INHA)gene,thepolymorphisms inexon1ofINHAanditsbilateralsequenceswereassayedusingPCRwithdirectsequencinginbuffalo,gayalandyak.A comparative analysis was conducted by pooled the results in this study with the published data of INHA on some mammalsincludingsomebovinespeciestogether.Asynonymoussubstitutionc.73C>Awasidentifiedinexon1ofINHA for buffalo,which results in identical encoding product in river andswamp buffalo. In gayal, two non-synonymous but samepropertysubstitutionsinexon1ofINHA,viz.c.62C>Tandc.187G>A,weredetected,whichleadtop.P21L,p. V63MchangesinINHA,respectively.Inyak,nucleotidesubstitutionc.62C>T,c.129A>Gwerefoundinexon1ofINHA, the former still causes p. P21Lsubstitution and the latter is synonymous. For the sequence of the 5'-flanking region of INHAexamined,noSNPswerefoundwithinthespecies,butasubstitution,c.-6T>G,wasfound.Thenucleotideinthis site in gayal, yak and cattle was c. -6G, whereas in buffalo it was c. -6T. Meanwhile, a 6-bp deletion, namely c. 收稿日期:2012-02-16; 接受日期:2012-04-13 基金项目: 云南省应用基础研究重点项目(2007C0003Z); 国家自然科学基金项目(30660024); 云南省应用基础研究计划面上项目(2006C0034M); 国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(2008AA101001); 云南省财政厅基金项目(槟榔江水牛种质特性研究) ∗通信作者(Correspondingauthor),E-mail:[email protected] #共同第一作者(Authorscontributedequallytothework) 第一作者简介: 苗永旺(1964—), 男, 博士，教授，从事动物遗传学教学和研究工作; 哈福(1974— ), 男, 博士, 副教授, 主要从事动物繁殖学教 学和科研工作 4期 高华山等: 水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因外显子1多态性分析 403 262+31_262+36delTCTGAC,wasfoundintheintronofbuffaloINHAgene.Forthisdeletion,wildtypes(+/+)account formainpartinriverbuffalowhilemutanttypes(-/-)arepredominantinswampbuffalo.Thisdeletionwasnotfoundin gayal,yakandcattle,thoughtheseallhaveanotherdeletionintheintronofINHA,c.262+78_262+79delTG.Theresults ofsequencealignmentshowedthatthesubstitutionsc.43Aandc.67Ginexon1ofINHAarespecifictobuffalo,whereas thesubstitutionsc.173Aandc.255Gareexclusivetogayal,yakandcattle,andc.24C,c.47G,c.174Tandc.206Tare specifictogoat.Furthermore,therearefewdifferencesamonggayal,yakandcattle,butthererelativelygreatdifferences betweenbuffalo,goatandotherbovinespeciesregardingthesequencesofINHAexon1. Keywords:Buffalo;Gayal;Yak;Inhibinαgene(INHA）exon1;Polymorphism 抑制素(inhibin,INH)是一种主要由性腺细胞分 进行了比较分析, 以揭示牛科物种INHA基因外显 泌的糖蛋白激素, 由α亚基和β亚基通过二硫键接合 子1的序列差异及其群体遗传特征。 而成(Thompsonetal,1994; Xueetal,2004)。α亚基 1 材料与方法 为抑制素的固有亚基,β亚基包含两种结构相似的β A亚基和βB亚基。α亚基分别与βA亚基和βB亚 1.1 材料 基结合, 被称作抑制素 A(inhibin-A)和抑制素 148头水牛样品分别采自3个河流型和11个沼 B(inhibin-B)(Thompsonetal,1994;Xueetal,2004)。 泽型水牛群体, 河流型水牛样品包括槟榔江水牛35 抑制素能够对促卵泡素(follicle-stimulating 头、摩拉水牛12头、尼里−拉菲水牛10头, 共57 hormone,FSH)的含量起到抑制作用(Thompsonetal, 头; 沼泽型水牛样品包括湖南滨湖水牛 4头、恩施 1994;Xueetal,2004), 从而调控雌性动物的卵泡生 水牛7头、盐津水牛8头、福安水牛9头、东流水 成。在雄性动物中, 抑制素α亚基(inhibinα-subunit, 牛7头、信丰水牛6头、滇东南水牛8头、江西滨 INHA)主要存在于精原细胞、精母细胞和早期的精 湖水牛7头、富钟水牛10头、德昌水牛18头、德 细胞中, 是睾丸间质细胞和支持细胞增殖、分化和 宏水牛7头, 共91头。8头大额牛样品采自云南省 类固醇合成潜在的旁分泌和自分泌调节因子(Sang 怒江州; 牦牛样品共12头, 其中8头采自西藏自治 etal,2011)。因此,INHA编码基因为控制家畜繁殖 区,4头采自云南省迪庆州中甸县。每头牛取耳组织 性状的重要候选基因, 具有很高的研究和利用价 或肌肉样, 低温带回实验室,－80 ℃冻存。 值。过去, 对INHA基因的研究主要集中在人、猪、 由 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 普通牛、山羊和绵羊等动物上(Thompsonetal,1994; 中下载了不同哺乳动物INHA基因第1外显子序列, Jeong et al, 2004; Xue et al, 2004; Zhou et al, 2007; 用于比较分析。序列包括: 水牛:EU884446; 普通牛: Fallahianetal,2009;Wuetal,2009;Dingetal,2011; U16237、M13273、NM_174094、L20601; 山羊: Sangetal,2011;Tangetal,2011)。Ensemble 数据库 EF602161、HQ699620、JN620334、JN620335; 牦 (http://www.ensembl.org/index.html)中公布的普通牛 牛 : JN572112; 猪 : AK235034 、 AK234503 、 INHA基因序列共含有2个外显子和1个内含子, 第 AK347411、DQ356013、M13980、NM_214189; 人: 一外显子编码区长为262bp, 第二外显子编码区长 NM_002191、X04445、AK292340、BC006391、 为821bp, 内含子长1836bp; 该基因编码序列长1 BC039076、BT006954、CU675381、M13144、M13981; 083bp, 共编码360个氨基酸。 猴: NM_001032955 和黑猩猩: XM_001148064。由 家养水牛分为河流型和沼泽型两种类型(Zhang, Ensembl数据库中下载了人和普通牛INHA基因全 2000), 有关水牛抑制素α亚基完整的编码区序列虽 序列(ENSG00000123999, ENSBTAG00000009972) 已有报道(Xie et al, 2009), 但目前有关两类水牛 也用于比较分析。 INHA 基因的遗传差异及群体遗传特征还未见报 1.2 基因组DNA的提取 道。在牛科物种中, 有关牦牛和大额牛INHA基因 采用酚/氯仿抽提法(Joseph&David,2002)提取 的研究也未见报道。本研究采用PCR产物直接测序 基因组DNA, 经紫外分光光度法检测其纯度和浓 法, 对水牛、牦牛和大额牛的 INHA 基因外显子 1 度,TE缓冲液稀释为50ng/μL, 保存于4 ℃备用。 进行了群体变异检测, 并结合已发表的包括普通牛 1.3 PCR引物设计和PCR扩增 和山羊等牛科物种在内的一些哺乳动物同源序列 根据普通牛 INHA 基因全序列(登录号: 404 动 物 学 研 究 33卷 ENSBTAG00000009972)并参考 GenBank 数据库 在INHA基因外显子1序列中, 发现水牛INHA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中水牛和普通牛该基 基因编码区第73位核苷酸处(本文以水牛序列起始 因 mRNA 序列(登录号: EU884446、BC109837、 密码子第一位核苷酸为+1记录突变位点)存在一个 M13273、NM_174094), 采用Oligo6软件设计扩增 SNP位点, 即为c.73C>A颠换,c.73C和c.73A基因 INHA基因外显子1及其旁侧序列的引物。PCR引 频率分别为0.8851和0.1149, 但此SNP并没有引起 物也作为测序引物。上游引物: 5'-GTAGAAGAG 编码氨基酸的改变。在沼泽型水牛中, 发现该位点 GGCGGTGGT-3', 下游引物: 5'-TCCTGAAATGTA 存在c.73C 和c.73A两个等位基因, 但c.73A等位 GGCGTTAT-3'。PCR 反应体系为 25 μL, 包含 基因仅以杂合状态存在。在河流型水牛中, 摩拉水 10×buffer2.5μL(Mg2+为1.5mmol/L), 上、下游引物 牛和尼里−拉菲水牛只存在等位基因c.73C, 而槟榔 各 0.4 μmol/L, dNTP 2.5 mmol/L, Taq 酶 1.25 U, 江水牛却含有c.73C和c.73A两个等位基因, 基因 DNA模板100ng。PCR程序为:95℃预变性5min; 频率分别为0.90和0.10, c.73A也仅以杂合状态存 然后, 94 ℃ 35 s, 57 ℃ 35 s, 72 ℃ 40 s, 30 个循环; 在。 72℃后延伸10min终止反应。 在大额牛中, 检测到INHA基因编码区第62、 1.4 PCR产物回收及测序 187位核苷酸处存在c.62C>T、c.187G>A替换, 前 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测效果,PCR 者引起了INHA中相应位置氨基酸由脯氨酸(Pro,P) 扩增效果好的样品, 经回收纯化后, 送北京百泰克 变为亮氨酸(Leu, L), 即 p. P21L; 后者引起了相应 生物技术有限公司进行正、反链双向测序。 氨基酸由缬氨酸(Val,V)变为甲硫氨酸(Met,M), 即 1.5 数据分析 p.V63M, 两者均为相同性质氨基酸的替换。INHA 使用DNAStar6.0软件包(DNAstarInc.)对测序 基因编码区 c.62 C>T 的非同义替换也发现存在牦 数据进行核对编辑后, 用ClustalX软件(Thompson 牛中。此外, 在牦牛该基因编码区第129位核苷酸 etal,1994)对序列进行比对。各物种序列一致性分 处发现存在c.129A>G替换, 但该替换为同义替换。 析采用DNAStar软件包进行, 再用MEGA4.0软件 在大额牛群体中发现的 c.62C>T、c.187G>A及在 (Tamura et al, 2007)进行突变位点输出, 并采用 牦牛群体中发现的 c.62C>T、c.129A>G替换均只 Kimura双参数模型构建系统发育树。 存在于杂合个体中。各SNP位点及其群体遗传组成 信息见表1。 2 结果与分析 在所得到的40bp的 5'侧翼序列中, 水牛、大额 2.1 物种内序列变异分析 牛和牦牛物种内均未发现SNP位点; 在种间, 发现 本研究获得水牛INHA基因外显子1及其两侧 大额牛与牦牛序列完全一致, 但它们与水牛的5'侧 序列长度为496bp, 包括外显子1序列262bp,5'侧 翼序列在-6位核苷酸上存在差异, 在水牛中该位置 翼序列40bp和内含子序列194bp。经比对, 各牛 为c. -6T, 在大额牛与牦牛中为c. -6G。与已发表 科物种INHA基因外显子1序列长度相同, 各物种 的普通牛序列相比, 发现普通牛中该位点也为 c. 内序列一致性在99.2%～99.6%之间。 -6G。 表1 牛科物种INHA基因外显子1序列的SNP位点及其基因型、基因频率 Tab.1 BovinespeciesSNPs,correspondinggenotypesandgenefrequenciesinINHAexon1 基因型/个体数 等位基因/基因频率 物种 变异位点 P值c Genotype/Individualnumber Allele/Genefrequency Species Variablesites Pvaluec WW Wm mm Wa mb 河流型水牛 c.73C>A CC/51 CA/6 AA/0 C/0.9474 A/0.0526 ﹥0.05 Riverbuffalo 沼泽型水牛 c.73C>A CC/63 CA/28 AA/0 C/0.8462 A/0.1538 ﹥0.05 Swampbuffalo 大额牛 c.62C>T CC/5 CT/3 TT/0 C/0.8125 T/0.1875 ﹥0.05 Gayal c.187G>A GG/5 GA/3 AA/0 G/0.8125 A/0.1875 ﹥0.05 牦牛 c.62C>T CC/9 CT/3 TT/0 C/0.8750 T/0.1250 ﹥0.05 Yak c.129A>G AA/9 AG/3 GG/0 A/0.8750 G/0.1250 ﹥0.05 荷斯坦奶牛d c.132A＞G AA/16 AG/18 GG/6 A/0.6250 G/0.3750 ﹥0.05 Holsteincowd a 野生型等位基因 (wild-typeallele);b, 突变型等位基因 (mutant-typeallele);c,Hardy-Weinberg平衡检验概率(Chi-squaretestforHardy-Weinbergequilibr- ium);d, 荷斯坦奶牛(holsteincow), 数据引自 (thedatawascitedfrom): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ss.cgi?Subsnp_id=46526661。 在INHA基因内含子所测出的序列中, 水牛的第 通过物种间序列比对, 发现INHA基因外显子 31~36 位核苷酸处发现有 6 个碱基的缺失, 即 c. 1序列中c.43A、c.67G和c.73A为水牛所特有, 其 262+31_262+36delTCTGAC, 将之命名为等位基因“-”; 中c.43A、c.67G导致水牛INHA第15、23位相应 而将水牛中无6个碱基缺失的类型命名为等位基因 氨基酸分别为精氨酸(Arg,R)和缬氨酸(Val,V), 即 “+”。在河流型水牛中, 摩拉水牛和尼里-拉菲水牛该 p.15R和p.23V, 而在其他物种中该位置核苷酸均 位置均为无缺失类型, 对应的基因型为+/+, 而槟榔江 为c.43G、c.67C, 相应的编码氨基酸分别为甘氨酸 水牛却含有+/+、+/-和-/-三种基因型个体, 所占比例分 (Gly,G)和亮氨酸(Leu,L), 即p.15G和p.23L。其 别为71.43%(25/35)、20.00%(7/35)和8.57%(3/35); 在沼 中, p. G15R 为非相同性质氨基酸的替换, p. L23V 泽型水牛中该位置存在+/+、+/-和-/-三种基因型, 所占 为相同性质氨基酸的替换。值得注意的是,INHA基 比 例 分 别 为 2.20%(2/91) 、 29.67%(27/91) 和 因外显子1序列中c.173A和c.255G 为普通牛、 68.13%(62/91)。在大额牛、牦牛和已发表的普通牛 大额牛和牦牛所共有, 而在其他牛科物种中为 c. INHA基因内含子中均未发现该缺失, 但与水牛序列相 173C和c.255A, 前者差异引起了普通牛、大额牛 比, 发现它们在内含子的第78~79位核苷酸处有2个碱 和牦牛的INHA第58位编码氨基酸由脯氨酸(Pro,P) 基的缺失, 即c.262+78_262+79delTG。 变为组氨酸(His, H), 为非相同性质氨基酸的替换; 2.2 物种间INHA基因外显子1序列差异 而后者为同义替换。在山羊中,INHA基因外显子1 本文所测序列与NCBI数据库上已发表的牛科 序列中c.24C、c.47G、c.174T和c.206T为山羊所 物种和人、猪等物种的同源序列进行比对, 确定各 特有, 在其他物种中该位置分别为c.24G、c.47A、 物种的单倍型。由水牛INHA基因外显子1序列变 c.174C和c.206G, 其中,c.24G>C、c.47A>G和c. 异定义两种单倍型: buffaloC 和 buffaloA; 由水牛 206G>T替换分别引起了在山羊 INHA第8、16和 INHA基因外显子1及其内含子序列变异共同定义4 69位编码氨基酸改变为p.L8F(F为苯丙氨酸,Phe)、 种单倍型:buffaloC(＋),、buffaloC(－),、buffaloA(＋) p.H16R和p.R23M,p.L8F和p.H16R替换为相同 和buffaloA(－)。依据INHA基因外显子1序列变异, 性质氨基酸的替换, 而p.R23M为非相同性质氨基 在大额牛中定义两个单倍型:gayalI1和gayalI2; 在牦 酸的替换。 牛中定义两个单倍型: yakI1和 yakI2; 在普通牛中, 2.3 系统发育分析 定义3个单倍型:cattleI1、cattleI2和cattleI3; 山羊中 基于各物种INHA基因外显子1不同单倍型序 也定义3个单倍型:goatI1、goatI2和goatI3。各单倍 列构建的系统发育树, 见图3。在系统发育树上, 普 型及其相应的蛋白质编码序列差异见图1和图2。 通牛、大额牛和牦牛间表现出较近的遗传关系, 它 牛科物种INHA基因外显子1与猪和灵长类同 们聚在一个较大的支系上, 而水牛和山羊等物种分 源序列差异较大。牛科物种与猪的序列一致性在 别聚在各自独立的分支上, 且有较高的支持率, 表 89.7%～90.9%之间, 与灵长类序列一致性在 现出水牛、山羊与大额牛、牦牛和普通牛间遗传关 83.3%～85.2%之间。而各牛科物种间INHA基因外 系较远。 显子1序列一致性在95.8%～100%之间, 其中, 大 3 讨 论 额牛、牦牛和普通牛间序列INHA基因外显子1序 列差异较小, 序列一致性在98.9%～100%之间, 单 本文在水牛群体中, 尽管检测出INHA基因外 倍型cattleI3与yakI1序列一致; 而山羊、水牛与大额 显子1存在c.73C>A替换, 但为同义替换, 河流型 牛、牦牛和普通牛间序列差异相对较大, 山羊与它 和沼泽型水牛在编码产物上相一致。对于该基因内 们间序列一致性在 95.8%～97.3%之间; 水牛与它 含子序列中的c. 262+31_262+36delTCTGAC缺失 们间序列一致性在 97.0%～98.5%之间; 水牛与山 而言, 河流型水牛倾向于+/+基因型, 而沼泽型水牛 羊之间序列一致性在96.6%～97.3%之间。 则倾向于-/-基因型。在槟榔江水牛INHA基因外显 收稿日期:2012-02-16; 接受日期:2012-04-13 基金项目: 云南省应用基础研究重点项目(2007C0003Z); 国家自然科学基金项目(30660024); 云南省应用基础研究计划面上项目(2006C0034M); 国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(2008AA101001); 云南省财政厅基金项目(槟榔江水牛种质特性研究) ∗通信作者(Correspondingauthor),E-mail:[email protected] #共同第一作者(Authorscontributedequallytothework) 第一作者简介: 苗永旺(1964—), 男, 博士，教授，从事动物遗传学教学和研究工作; 哈福(1974— ), 男, 博士, 副教授, 主要从事动物繁殖学教 学和科研工作 406 动 物 学 研 究 33卷 子1中存在c.73C>A替换以及在其内含子中存在c. 对该水牛的报道相一致(Miaoetal,2011)。在大额牛 262+31_262+36delTCTGAC缺失, 提示槟榔江水牛 群体中发现的c.62C>T、c.187G>A及在牦牛群体 与国外著名的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛相比, 选 中发现的c.62C>T、c.129A>G替换, 在遗传上是连 育程度低, 并存在沼泽型水牛基因渗入, 这与以往 锁的, 且处于Hardy-Weinberg 平衡状态。由于在 图1 INHA基因外显子1及其两侧翼序列各单倍型核苷酸差异 Fig.1 NucleotidedifferencesofhaplotypesdetectedinINHAexon1anditsbilateralsequences 图中核苷酸差异的记录以水牛INHA基因编码区序列起始密码子第一位核苷酸为起点(﹢1), 点(•)代表与水牛参考序列相一致, 横线(-)代表核苷酸缺 失, 问号(?)代表数据信息缺失。M: 代表负号“﹣”。阴影部分为牛科物种INHA基因内含子部分序列之间的核苷酸差异位点, 而框起来的部分为5'侧 翼序列核苷酸差异位点。(﹢): 水牛INHA基因内含子第31~36位核苷酸无缺失类型;(﹣): 水牛INHA基因内含子第31~36位核苷酸有缺失类型。 Numberingisscoredrelativetofirstnucleotide(﹢1)ofthestartcodoninthecodingsequenceofINHAgeneinbuffalo.Dots(•)denoteidentitywiththe buffaloreferencesequence.Dashes(-)indicatedeletionsofnucleotidesinthesequence.Missinginformationinthesequenceisdemonstratedbyquestionmark 4期 高华山等: 水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因外显子1多态性分析 407 (?). M: minus “﹣”. Nucleotide substitutions found in the intron of INHA gene between some bovine species are the shaded part and those found in the 5'-flankingregionareboxed.(﹢):wildtype,withoutthe6nucleotidedeletionsintheintronsequenceofINHAgeneinbuffalo;(﹣):mutationtype,withthe6 nucleotidedeletionsintheintronsequenceofINHAgeneinbuffalo,namelyc.262+31_262+36delTCTGAC. - 的保守性。 各物种序列比对及系统发育分析结果表明, 大 额牛、牦牛和普通牛间INHA基因外显子1序列差 异较小, 序列一致性较高, 而山羊和水牛与它们的 差异相对较大, 这揭示大额牛、牦牛和普通牛间遗 传关系较近, 它们的INHA基因在功能上具有相似 性; 而山羊和水牛与它们间遗传关系较远,INHA基 因在功能上可能与大额牛、牦牛和普通牛存在一定 差异性。这种差异是否与水牛的繁殖率普遍偏低, 以及山羊较高的繁殖率有关, 需进一步深入研究。 该基因5'侧翼序列第-6位核苷酸, 在大额牛、牦牛 和普通牛中均为c.-6G型, 而在水牛中为c.-6T型, 也揭示大额牛、牦牛和普通牛间较近的遗传关系。 以往研究揭示, 该区域在普通牛中为转录因子 图2 INHA基因外显子1序列各单倍型相应的 Ap-2(activatorprotein2)的作用位点(Thompsonetal, 编码氨基酸差异 1994), 以上差异是否反映水牛INHA基因在表达上 Fig.2 Aminoaciddifferencesencodedbyhaplotype sequencesofINHAexon1amongvariousspecies 与大额牛、牦牛和普通牛有差异需进一步研究。在 图中氨基酸排列以水牛INHA蛋白起始氨基酸为起点, 点(•)代表与水牛 水牛内含子序列中发现的 c. 262+31_262+ 36del 氨基酸序列相一致, 横线(-)代表氨基酸缺失。 TCTGAC缺失, 在其他物种中都不存在, 说明该缺 NumberingisscoredrelativetostartaminoacidinINHAinbuffalo.Dots(•) denotethebuffaloaminoacidsequence.Dashes(-)indicatethedeletionsof 失可能是水牛中独有的。另外, 在大额牛、牦牛和普 nucleotidesinthesequence. 通牛发现的c. 262+78_262+79delTG缺失可作为区 分水牛的分子标记; 在INHA基因外显子1序列中为 普通牛、大额牛和牦牛所特有的核苷酸c.173A和c. 255G, 在水牛中特有的核苷酸c.43A、c.67G, 在山 羊中特有的核苷酸c.24C、c.47G、c.174T、c.206T, 可作为分子标记进行水牛、山羊与普通牛、大额牛 和牦牛3个物种间的区分。以上标记可用于畜产品 种类等方面的鉴定, 在畜牧生产上加以利用。 已有研究结果揭示, 体内INHA水平与成年男 性的精子数量和睾丸体积呈正相关(Sangetal,2011), 与女性卵巢早衰相关(Jeongetal,2004;Fallahianetal, 2009)。在中国荷斯坦牛中,INHA基因外显子1 的 图3 基于各物种INHA基因外显子1单倍型序列 c.132A>G替换(参考文献中为c.192A>G)与超数排卵 构建的系统发育树 Fig.3 Phylogenetictreebasedonhaplotypesequencesof 效果相关, 与精子顶体完整率有显著的相关, 即GG INHAexon1invariousspecies 基因型较AA基因型个体具有较高的精子顶体完整 率和较好的超数排卵效果(Sangetal,2011;Tangetal, 水牛、大额牛和牦牛群体中发现的SNPs为同义替 2011)。本研究在水牛、大额牛和牦牛群体中未发现 换或相同性质氨基酸的替换, 揭示各牛科物种 c.132A>G型个体, 即群体中均为GG基因型个体。 INHA基因外显子1的不同单倍型在功能上差异不 在小尾寒羊INHA基因外显子1中发现c.231T>C替 大, 提示牛科物种内INHA基因在功能上具有一定 换与繁殖力性状具有一定关联性,CC型个体比TT 408 动 物 学 研 究 33卷 个体具有较高的繁殖力(Zhouetal,2007)。本研究在 现该SNP与繁殖性状有直接关系(Wuetal,2009)。本 水牛、大额牛和牦牛群体中未发现c.231C型, 即它 研究在大额牛、牦牛和普通牛中也发现存在c.129A 们群体中均为TT基因型个体。以上结果是否在一定 型, 但在水牛中只有c.129G。 程度上揭示了水牛、大额牛和牦牛的精子顶体完整 本文揭示了牛科物种INHA基因外显子1的遗 率高和超数排卵效果好及它们的繁殖力(它们多为单 传特征, 可为从分子水平开展牛科物种繁殖性状的 胎)比绵羊低, 尚需进一步验证。有人在波尔山羊 选育提供参考。 INHA基因外显子1中发现SNPc.129G>A, 但并未发 参考文献: Ding CY, Chen B, Liu XQ, He CQ. 2011. 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