DÉBORA SOARES DA SILVA OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE UMA METODOLOG IA ANALÍTICA PARA A DETERMINAÇÃO DE PRODUTOS DA CONVERSÃO DA CELULOSE DÉBORA SOARES DA SILVA OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE UMA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA A DETERMINAÇÃO DE PRODUTOS DA CONVERSÃO DA CELULOSE Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas como requisito para obtenção do grau de Mestre em Química Analítica. Orientadora: Profa. Dra. Janaína Heberle Bortoluzzi Co-orientadora: Profa. Dra. Rusiene Monteiro de Almeida Maceió, 10 de Março de 2017 Catalogação na fonte Universidade Federal de Alagoas Biblioteca Central Bibliotecário Responsável: Valter dos Santos Andrade S586o Silva, Débora Soares da Otimização e validação de uma metodologia analítica par a determinação de Produtos da conversão da celulose / Débora Soares da Silva. – 2017. 91 f. : il. Orientadora: Janaína Heberle Bortoluzzi. Coorientadora: Rusiene Monteiro de Almeida. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Alagoas. Instituto de Química e Biotecnologia. Maceió, 2017. Bibliografia: f. 83-91. 1. Conversão. 2. Celulose. 3. Otimização. 4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) - Validação. I. Título. CDU: 544.47 À minha mãe, fonte de minhas forças e à minha irmã, exemplo que sempre procurei seguir, dedico-lhes este trabalho. AGRADECIMENTOS À Deus, por me dar força, discernimento e sabedoria frente à todas as adversidades. A toda a minha família, em especial a minha amada mãe, Noemia, por todo seu amor e carinho em todos os momentos da minha vida e a minha irmã Daniela, por todo incentivo e companheirismo, com todo carinho, meu muito obrigada. A minha orientadora, Profa. Janaína e co-orientadora, Profa. Rusiene pela amizade, apoio, paciência, atenção e transferência de conhecimento desde a iniciação científica até a orientação desta dissertação. A Profa. Dra. Andréa Pires Fernandes, Profa. Dra. Simoni Margareti Plentz Meneghetti, Prof. Dr. Diógenes Meneses e à Profa. Dra. Jailma Barros dos Santos por aceitarem o convite para participação da banca de defesa do mestrado. Ao Cristian que me auxiliou tanto no manuseio do HPLC quanto em questionamentos teóricos surgidos e não menos importante tornou-se um grande amigo, compartilhando momentos tristes, cansativos, estressantes, porém, gratificantes, e sim tiveram momentos felizes, descontraídos e de muitas risadas. Obrigada querido amigo! À todos os colegas de pesquisa do Grupo de Catálise e Reatividade Química, em especial ao Filipe, Lucas, Josinha e Nilson, por todos os momentos de descontração, companheirismo e experiências científicas. À todos os professores do Instituto Química e Biotecnologia pelo comprometimento e empenho durante todo o curso de Mestrado em Química Analítica. À Capes pelo apoio e bolsa concedida. À secretaria da Pós-Graduação e todos os funcionários. Muito Obrigada! RESUMO Devido à grande demanda energética global e a preocupação com a preservação ambiental, a utilização de fontes de energia renovável está se tornando uma estratégia muito importante. Neste sentido, a celulose é atualmente um dos recursos renováveis mais abundantes e promissores, pois através do seu processamento pela reação de hidrólise são obtidos biocombustíves e insumos de grande interesse industrial, como: hidroximetilfurfural (HMF), dihidroxiacetona (DHA), piruvaldeído, gliceraldeído e os ácidos acético, fórmico, lático e levulínico. Diante disso, o presente trabalho propõe a otimização e a validação de uma metodologia analítica baseada na técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinação dos produtos da conversão da celulose. A otimização do método proposto foi avaliada de forma univariada e de forma multivariada. No método otimizado por HPLC utiliza uma coluna de troca catiônica, uma solução de H SO , 2 4 como fase móvel com pH=1,41, temperatura da coluna e do detector de 42˚C e 30˚C, respectivamente, fluxo de 0,9 mL/min e tempo total de análise de 25,40 minutos. Para este estudo foram utilizados 10 padrões analíticos (glicose, frutose, gliceraldeído, piruvaldeído, ácido lático, dihidroxiacetona, ácido fórmico, ácido acético, ácido levulínico e HMF). O método de HPLC foi validado através da verificação de parâmetros como, seletividade, linearidade, limite de detecção e limite de quantificação, precisão (repetitividade, precisão intermediária, precisão instrumental), exatidão e robustez. Estes parâmetros foram avaliados levando-se em consideração tanto a área quanto à altura dos picos. As curvas analíticas apresentaram coeficiente de correlação ≥ 0,9972. A metodologia proposta mostrou- se sensível e precisa para a faixa de concentração adotada de 5 a 500 µg/mL. Na precisão instrumental, precisão intermediária e repetitividade foram obtidos valores de CV ≤ 6,33%. A exatidão do método apresentou valores de recuperação de 90,58 a 106,87%, o método proposto é robusto apenas para pequenas variações de pH (±1) e temperatura (±5) para dihidroxiacetona, glicose e piruvaldeído, fato que pode ser explicado pelo alto valor de temperatura e pH, ficando esta variação para estudos futuros. Palavras chaves: Celulose. Otimização. Validação. HPLC. ABSTRACT Due to high global energy demand and a concern for environmental preservation, a renewable energy source is becoming a very important strategy. In this sense, a cellulose is one of the most abundant and promising renewable resources, as its treatment by hydrolysis reaction are obtained biofuels and inputs of great industrial interest, such as: hydroxymethylfurfural (HMF), dihydroxyacetone (DHA), pyruvatedehyde, glyceraldehyde Acetic, formic, lactic and levulic acids. Therefore, the present work proposes an optimization and validation of an analytical methodology in the technique of high performance liquid chromatography (HPLC) for the determination of cellulose conversion products. The optimization of the proposed method was evaluated in a univariate and multivariate fashion. In the HPLC- optimized method, a cation exchange column, a solution of H 2 SO 4, was used as mobile phase with pH = 1.41, column temperature and detector of 42 ° C and 30 ° C respectively, flow of 0.9 mL / Min and total analysis time of 25.40 minutes. 10 analytical standards (glucose, fructose, glyceraldehyde, pyruvate, lactic acid, dihydroxyacetone, formic acid, acetic acid, levulinic acid and HMF) were used for this study. The HPLC method was validated by parameter selection, selectivity, linearity, limit of detection and limit of quantification, precision (repeatability, intermediate precision, instrumental accuracy), accuracy and robustness. These have been taken into consideration both the area and the height of the peaks. Analytical curves showed correlation coefficient ≥ 0.9972. The proposed methodology proved to be sensitive and accurate for a range of 5 to 500 μg / mL. In the instrumental precision, intermediate accuracy and repeatability values of CV ≤ 6,33% were obtained. Accuracy offers assessment methods from 90.58 to 106.87%, the proposed method is robust only for small variations of pH (± 1) and temperature (± 5) for dihydroxyacetone, glucose and pyruvate, which can be explained by the high temperature and pH values. Keywords: Cellulose. Optimization. Validation. HPLC. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Emissões de dióxido de carbono relacionadas com a energia do mundo por tipo de combustível, 1990-2040 (bilhões de toneladas) ......................................19 Figura 2. Geração líquida de eletricidade mundial por fonte de energia, 2012 - 40 (trilhões de quilowatts-horas) ....................................................................................20 Figura 3. Principais componentes da biomassa lignocelulósica................................21 Figura 4. Distribuição dos importantes componentes orgânicos da biomassa lignocelulósica............................................................................................................21 Figura 5. Representação esquemática da molécula de celulose .............................21 Figura 6. Mecanismo de hidrólise da celulose catalisada por ácido .........................24 Figura 7. Possibilidades de aplicações dos derivados químicos da celulose ..........25 Figura 8. Isomerização da glicose emfrutose............................................................26 Figura 9. Reações de conversão da frutose..............................................................27 Figura 10. Estrutura da coluna MetaCarb 87H, copolímero de estireno divinilbenzeno sulfonado na forma de H+...................................................................30 Figura 11. Detecção por IR de analitos presentes em diferentes amostras..............31 Figura 12. Parâmetros de avaliação da resolução em cromatografia ......................40 Figura 13. Separação em função da Rs (razão: pico-altura) ....................................41 Figura 14. Representação gráfica da matriz Doehlert com duas variáveis ( __ ) com adição de novos experimentos (....)...........................................................................51 Figura 15. Cromatograma obtido na análise da solução de 1000 µg/mL dos padrões: 1-glicose, 2- frutose, 3- gliceraldeído, 4-piruvaldeído, 5-ácido lático, 6- dihidroxiacetona, 7-ácido fórmico, 8-ácido acético, 9- ácido levulínico e 10-HMF. Fase móvel H SO (pH 1,27), fluxo 0,70 mL/min, temperatura da coluna 55 ºC.......54 2 4 Figura 16. Efeito do pH na resolução dos compostos. Compostos 5, 6, 8 e 9, são ácido lático, dihidroxiacetona, ácido acético e ácido levulínico, respectivamente ....55 Figura 17. Efeito da temperatura da coluna na resolução dos compostos. Compostos 5, 6, 8 e 9, são ácido lático, dihidroxiacetona, ácido acético e ácido levulínico, respectivamente........................................................................................57 Figura 18. Efeito da temperatura do detector na resolução dos compostos. Compostos 5, 6, 8 e 9, são ácido lático, dihidroxiacetona, ácido acético e ácido levulínico, respectivamente........................................................................................58 Figura 19. Efeito da taxa de fluxo da fase móvel na resolução dos compostos. Compostos 5, 6, 8 e 9, são ácido lático, dihidroxiacetona, ácido acético e ácido levulínico, respectivamente .......................................................................................59 Figura 20. Diagrama de Pareto do efeito das variáveis na resolução dos picos 5,6 e 8,9. Os números 5 e 6, 8 e 9 correspondem aos compostos ácido lático e dihidroxiacetona e ácido acético e ácido levulínico, respectivamente ......................61 Figura 21. Gráfico de Superfície resposta em função das variáveis pH e temperatura na resolução dos picos 1/2 (A); 2/3 (B); 3/4 (C) e 4/5 (D) .........................................63 Figura 22. Gráfico de Superfície resposta em função das variáveis pH e temperatura na resolução dos picos 5/6 (E); 6/7 (F); 7/8 (G); 8/9 (H) e 9/10(I) .............................64 Figura 23. Cromatogramas obtidos das análises de seletividade para a matriz isenta (cor rosa) e matriz fortificada com os padrões de trabalho (em preto).......................68 Figura 24. Curvas analíticas da determinação pela área do pico de cada padrão analítico. (A) – Glicose; (B) – Frutose; (C) – Gliceraldeído; (D) – Piruvaldeído; (E) - Ácido lático; (F) – Dhidroxiacetona; (G) – Ácido fórmico; (H) – Ácido acético; (I) – Ácido levulínico e (J) HMF .........................................................................................69 Figura 25. Curvas analíticas da determinação pela altura do pico de cada padrão analítico. (A) – Glicose; (B) – Frutose; (C) – Gliceraldeído; (D) – Piruvaldeído; (E) - Ácido lático; (F) – Dhidroxiacetona; (G) – Ácido fórmico; (H) – Ácido acético; (I) – Ácido levulínico e (J) HMF ........................................................................................71 Figura 26. Cromatograma obtido na aplicação do método para a reação de hidrólise da celulose. Condições reacionais: temperatura de 190°C, à 10 bar, com 60 mL de água deionizada, catalisador MoO /TiO , 0,48g de celulose e tempo reacional de 1h. 3 2 Picos 1,2,3,4,5,6 e 7 são equivalentes aos compostos glicose, frutose, gliceraldeído, ácido lático, ácido fórmico, ácido acético e HMF, respectivamente ....................................................................................................................................84 Figura 27. Cromatograma obtido na aplicação do método para a reação de conversão da frutose. Condições reacionais: temperatura de 190ºC, à 10 bar, com