NANOGENOMICS AND NANOPROTEOMICS ENABLING PERSONALIZED, PREDICTIVE AND PREVENTIVE MEDICINE Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von MD Nicola Luigi Bragazzi aus Carrara Marburg/Lahn 2014 Erstgutachter: - Prof. Dr. Norbert Hampp Zweitgutachter: - Prof. Dr. Claudio Nicolini Prüfungstermin: 16.01.2014 Hochschulkennziffer: 1180 Vom Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg (Hochschulkennziffer: 1180) als Dissertation am ___.___.201_ angenommen am: Tag der mündlichen Prüfung: __________________ Erstgutachter: Prof. Dr. N. Hampp Zweitgutachter: Prof. Dr. C. Nicolini Die vorliegende Dissertation wurde unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. Norbert Hampp (Fachbereich Chemie, Philipps-Universität Marburg) in der Zeit von Juli 2011 bis Dezember 2013 an den Laboratories of Biophysics and Nanobiotechnologies, Department of Experimental Medicine (DIMES), Faculty of Medicine, University of Genoa, Via Antonio Pastore 3, Genoa (Italy) angefertigt. E r k l ä r u n g gemäß § 10, Abs. 1 der Promotionsordnung der Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fachbereiche und des Medizinischen Fachbereichs für seine mathematisch-naturwissenschaftlichen Fächer der Philipps- Universität Marburg vom 28.4.2010 Ich versichere, dass ich meine Dissertation „Nanogenomics And Nanoproteomics Enabling Personalized, Predictive And Preventive Medicine“ selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient, sowie alle vollständig oder sinngemäß übernommenen Zitate als solche gekennzeichnet habe. Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient. Marburg, den 4.1.2014 _____________________________ Nicola Luigi Bragazzi “Not only is the Universe stranger than we think, it is stranger than we can think.” Werner Heisenberg, Across the Frontiers Contents TABLE OF CONTENTS 1. Acknowledgments ……………………………........................................7 2. Abstract ………………………………............…………..........………..8 2.1 Abstract in German ………………………….....................................8 2.2 Abstract in English …………………………………………..........10 3. Nanomedicine: definition and main goals ……………………...........12 4. Nanogenomics ……………………………….................................…...21 4.1. DNASER ……………………………………….............................26 4.2. Leader Gene Algorithm ………………………………...................29 5. Nanoproteomics ….................................................................................34 5.1 Structural Proteomics and Protein Nanocrystallography …..............38 5.2 Functional nanoproteomics …...........................................................66 5.2.1. NAPPA .....................................................................................66 5.2.2. Nanoconductometric QCM_D..................................................69 5.2.3. APA ….....................................................................................73 5.2.4. Mass Spectrometry...................................................................76 6. Medical Applications ….........................................................................81 6.1. A state-of-art of the literature …......................................................81 6.2. Bioinformatics ab initio medical applications ….............................85 6.2.1. Applications in the field of Nanonephrology ….....................85 6.2.2. Applications in the field of Oral Pathology ….......................104 5 Contents 6.3. NAPPA QCM_D based applications …........................................123 7. Conclusions ….......................................................................................151 8. Appendixes ….......................................................................................153 8.1. Appendix I .....................................................................................153 9. Bibliography ….....................................................................................162 10. Curriculum Vitae et Studiorum of the PhD candidate ….................202 11. List of publications ………………………………………………...203 6 Acknowledgments 1. ACKNOWLEDGMENTS First of all, I would like to acknowledge my PhD Thesis advisors Professor Claudio Nicolini who gave me the chance to work in his team, trusted in my skills, made me love the fascinating world of the nanobiotechnologies and supported me during the difficulties and the hard time, and Professor Norbert Hampp, who accepted me in his team, trusting too in my attitudes. I want to thank him particularly for his patience, suggestions and tips that have improved a lot my PhD thesis and presentation. His Arbeitsgruppe (AG) in Marburg represents a unique and incredibly stimulating environment for making science and research. I would like to acknowledge also Professor Eugenia Pechkova that guided me through every project giving me precious suggestions on how to improve my scientific skills and made me know and love protein crystallography. Finally, I would like to acknowledge every single co-author of the projects in which I was involved. Dr. Nicola Luigi Bragazzi, Genoa-Marburg 2011-2014 7 Abstracts 2. ABSTRACT 2.1 ZUSAMMENFASSUNG IN DEUTSCH Seit der Entdeckung von Nucleic Acid hat die Molekularbiologie enorme Fortschritte gemacht und vieles erreicht. Trotz all dem, besteht immer noch eine Lücke zwischen dem klassich-traditionellen medizinischen Ansatz, und der Molekularen Welt. Inspiriert durch die riesigen Datenmengen, die durch die "omics"-geführten Techniken und die "high-throughput" Techniken (HTTs) entstanden sind, habe ich versucht ein Protokoll zu entwickeln, welches die Hürde zwischen der phenomenlogogical Medizin und der Molekularmedizin überbrücken soll, und somit das Labor dem Patientenbett etwas näher bringen wird. Ausserdem finde ich, dass es dringend nötig ist die wichtigsten "omics" Wissenschaften - Genomics und Proteomics - miteinander zu integrieren. Nucleic Acid Programmable Protein Arrays (NAPPA) können dies erreichen, durch die Verwendung eines "complex mammalian cell free expression" Systems um die Proteine in situ zu erzeugen. Als Alternative zu "fluorescent-labelled" Ansätzen, kann eine neue kennzeichnungsfreie Methode, die durch den kombinierten Einsatz von drei unabhängigen und komplementären nanobiotechnologischen Ansätzen entsteht, verwendet werden. Diese Methode mag fähig sein das Zusammenspiel von Gen- und Proteinfunktionen, Gen-Proteine, Gen-Medikamente, Protein-Proteine und Protein-Medikamente zu analysieren. Dies wäre sehr Vorteilhaft für die personalisierte Medizin. Quartz Micro Circuit Nanogravimetry (QCM), 8 Abstracts basierend auf Frequenz- und Zerstreuungsfaktoren, Massenspektrometrie (MS) und Anodic Porous Alumina (APA) überwinden fürwahr die Grenzen von "correlated fluorescence detection", welches darunter leidet, dass es trotz gründlichem Waschen im Hintergrund weiterhin detektiert werden kann. Ausserdem wird momentan daran gearbeitet ein "homogeneous and well defined bacterial cell free expression system" weiter zu optimieren, welches die ambitionierten Ziele der Quantifizierung der bestimmenden Gene und Protein Netzwerke im menschlichen Körper verwirklichen kann. Implikationen für die personalisierte Medizin der oben erwähnten kennzeichnungsfreien Protein Arrays mit dem Einsatz verschiedener Test- Gene und Proteine, werden in dieser PhD-Arbeit besprochen. 9 Abstracts 2.2 ABSTRACT IN ENGLISH Since the discovery of the nucleic acid, molecular biology has made tremendous progresses, achieving a lot of results. Despite this, there is still a gap between the classical and traditional medical approach and the molecular world. Inspired by the incredible wealth of data generated by the "omics"-driven techniques and the “high-trouhgput technologies” (HTTs), I have tried to develop a protocol that could reduce the actually extant barrier between the phenomenological medicine and the molecular medicine, facilitating a translational shift from the lab to the patient bedside. I also felt the urgent need to integrate the most important omics sciences, that is to say genomics and proteomics. Nucleic Acid Programmable Protein Arrays (NAPPA) can do this, by utilizing a complex mammalian cell free expression system to produce proteins in situ. In alternative to fluorescent-labeled approaches a new label free method, emerging from the combined utilization of three independent and complementary nanobiotechnological approaches, appears capable to analyze gene and protein function, gene-protein, gene-drug, protein-protein and protein-drug interactions in studies promising for personalized medicine. Quartz Micro Circuit nanogravimetry (QCM), based on frequency and dissipation factor, mass spectrometry (MS) and anodic porous alumina (APA) overcomes indeed the limits of correlated fluorescence detection plagued by the background still present after extensive washes. Work is in progress to further optimize this approach a homogeneous and well defined bacterial cell free expression system able to realize the ambitious objective to quantify the regulatory gene and protein networks in humans. 10