Modellsynthesen und Strukturaufklärung von Polyketiden sowie Arbeiten zur Biosynthese von Mimosin Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Georg-August-Universität zu Göttingen Vorgelegt von Falko Degenhardt aus Kassel Göttingen 2000 D 7 Referent: Prof. Dr. J. Rohr Korreferent: Prof. Dr. A. de Meijere Tag der mündlichen Prüfung: 30.10.2000 Die vorliegende Arbeit wurde im Institut für Organische Chemie der Universität Göttingen von Juli 1997 bis August 2000 unter Anleitung von Prof. Dr. Jürgen Rohr durchgeführt Herrn Prof. Dr. Jürgen Rohr danke ich für die Überlassung der hochinteressanten Themen sowie für viele Anregungen und Diskussionen A. THEORETISCHER TEIL..............................................................................................................1 1. ALLGEMEINE EINFÜHRUNG..........................................................................................................1 1.1 EINLEITUNG......................................................................................................................................1 1.2 AUFGABENSTELLUNG........................................................................................................................5 2. POLYKETIDE......................................................................................................................................7 2.1 EINFÜHRUNG....................................................................................................................................7 2.2 KOMBINATORISCHE BIOSYNTHESE...................................................................................................11 2.3 POLYKETIDSYNTHESEN...................................................................................................................17 2.4 SYNTHESESTRATEGIE......................................................................................................................20 2.5 DARSTELLUNG VON 3-HYDROXYHOMOPHTHALAT (12).....................................................................22 2.6 KETTENVERLÄNGERUNG AN HOMOPHTHALSÄUREESTER (12)...........................................................27 2.7 KETTENVERLÄNGERUNGEN AN 1,8-DIHYDROXY-2-(METHOXYCARBONYL)-3-NAPHTHYL ACETAT (13)29 2.7.1 Darstellung des Naphthalenderivates (13)...............................................................................29 2.7.2 Kettenverlängerungen zu (22) und (23)....................................................................................30 2.8 DISKUSSION UND AUSBLICK............................................................................................................32 3. MAKROPOLYENE BZW. POLYEN-MAKROLIDE.......................................................................36 3.1 EINFÜHRUNG..................................................................................................................................36 3.2 DIE BESONDERHEIT DER MAKROPOLYENE........................................................................................42 3.3 STREPTOMYCES SP106....................................................................................................................47 3.3.1 Fermentation und Isolierung...................................................................................................47 3.4 STRUKTURAUFKLÄRUNG.................................................................................................................49 3.4.1 Literaturrecherche..................................................................................................................49 3.5 STRUKTURAUFKLÄRUNG VON SUBSTANZ 4 (33) BZW. RIMOCIDIN.....................................................50 3.6 DERIVATISIERUNG VON RIMOCIDIN..................................................................................................51 3.6.1 Acetylierung der Aminogruppe................................................................................................51 3.6.2 Amidierung der Carbonsäuregruppe an Position 14................................................................52 3.7 STRUKTURAUFKLÄRUNG VON RIMOCIDIN-DERIVAT (37)..................................................................53 3.7.1 Mycosamin-Derivat (38)..........................................................................................................53 3.8 CHARAKTERISIERUNG DER STRUKTUREN VON SUBSTANZ 2 (32).......................................................57 3.8.1 Aufklärung des Zuckers: Mycosamin(35).................................................................................57 3.8.2 Teilstruktur A vom Aglykon.....................................................................................................59 3.8.3 Teilstruktur B..........................................................................................................................60 3.8.4 Teilstruktur C..........................................................................................................................62 3.8.5 Nebenprodukte Substanz 1 (39) und Substanz 3.......................................................................63 3.8.6 Test auf Aktivität gegen Hefepilze............................................................................................63 3.9 DISKUSSION UND AUSBLICK............................................................................................................65 4. MIMOSIN...........................................................................................................................................66 4.1 EINFÜHRUNG..................................................................................................................................66 4.2 DETAILS ZU DER PFLANZENART LEUCAENA LEUCOCEPHALA...............................................................67 4.2.1 Geschichte..............................................................................................................................68 4.2.2 Verwendung............................................................................................................................68 4.2.3 Nährstoffgehalt von Leucaena leucocephala............................................................................68 4.2.4 Verwendung als Futtermittel für Tiere.....................................................................................69 4.2.5 Problem mit Pflanzenschädlingen............................................................................................69 4.2.6 Toxizität von Mimosin (40) und 3,4-Dihydroxypyridin (41)......................................................69 4.3 PHARMAKOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN............................................................................................71 4.3.1 Mimosin (40) als Tyrosin Antagonist.......................................................................................71 4.3.2 Mimosin (40) als potentielles Antikrebsmittel...........................................................................72 4.3.3 Auswirkungen von Mimosin (40) auf HIV-1 Viren....................................................................72 4.4 SYNTHESE VON MIMOSIN (40).........................................................................................................73 4.4.1 Verwendung von Mimosin (40) in der Peptidchemie.................................................................73 4.5 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON MIMOSIN (40) UND DIHYDROXYPYRIDIN (41) AUS L. LEUCOCEPHALA.....................................................................................................................................74 4.5.1 Bekannte Methoden.................................................................................................................74 Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________ 4.5.2 Isolierung von Mimosin (40)....................................................................................................74 4.6 SPEKTROSKOPISCHE DATEN.............................................................................................................76 4.6.1 Mimosin (40)...........................................................................................................................76 4.6.2 3,4-Dihydroxypyridin (41).......................................................................................................77 4.7 STAND DER BISHERIGEN FORSCHUNGEN ZUR BIOSYNTHESE VON MIMOSIN (40).................................78 4.7.1 Studien mit [2-14C]-DL-Lysin-monochlorid (42).......................................................................78 4.7.2 Fütterungsversuche mit [3-14C]-Asparaginsäure (45)...............................................................80 4.7.3 Bekannte Biosynthesen von Lysin (42).....................................................................................81 4.7.4 Cystein Synthase katalysiert Mimosinbildung...........................................................................83 4.8 ZUSAMMENFASSUNG DER LITERATURDATEN....................................................................................84 4.9 NEUE BIOSYNTHETISCHE STUDIEN...................................................................................................86 4.9.1 Biosynthetische Studien mit markiertem Lysin (42)..................................................................86 4.10 WIE ÜBERFÜHRT MAN DIE MARKIERTEN SUBSTANZEN IN DIE PFLANZE?..........................................88 4.10.1 I.D. Spenser`s Methode.........................................................................................................88 4.10.2 J.W. Hylin´s Methode............................................................................................................89 4.10.3 Fütterung an einem abgeschnittenen Zweig............................................................................90 4.11 FÜTTERUNGSEXPERIMENTE............................................................................................................91 4.11.1 Vorversuche..........................................................................................................................91 4.11.2 Versuche zur Steigerung der Mimosinproduktion...................................................................92 4.11.3 Radioaktive Fütterungsversuche mit 14C-L-Lysin (42)............................................................94 4.11.4 Versuchsbedingungen............................................................................................................94 4.11.5 Allgemeine Meßprozedur.......................................................................................................95 4.11.6 Daten zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivität...........................................................96 4.11.7 Fütterungsversuche...............................................................................................................96 4.12 FÜTTERUNG MIT [2-13C]-DL-LYSIN * 2HCL (42)............................................................................98 4.12.1 Begründung........................................................................................................................100 4.13 RADIOAKTIVE FÜTTERUNG MIT GERINGER LYSIN-KONZENTRATION..............................................101 4.14 RADIOAKTIVE FÜTTERUNGEN NACH DER METHODE VON J.W. HYLIN............................................101 4.15 ENTWICKLUNG EINES SYSTEMS FÜR SPEZIELLE FÜTTERUNGSEXPERIMENTE UND SPÄTERE GENETISCHE UNTERSUCHUNGEN.............................................................................................................................103 4.15.1 Kultivierung von Pflanzenzellen (Kallus).............................................................................103 4.15.2 Testen verschiedener Regulatoren.......................................................................................107 4.15.3 Beobachtungen der Untersuchungen....................................................................................109 4.16 DISKUSSION UND AUSBLICK........................................................................................................110 5. ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE.................................................................................113 1. POLYKETIDSYNTHESE................................................................................................................113 2. MAKROPOLYENE.......................................................................................................................113 3. BIOSYNTHESE VON MIMOSIN (40)...............................................................................................114 B. EXPERIMENTELLER TEIL..........................................................................................................115 1. ALLGEMEINE METHODEN.........................................................................................................115 2. POLYKETIDSYNTHESEN.............................................................................................................122 2.1 DARSTELLUNG VON 3-TRIMETHYLSILOXYBUT-2-ENOAT (17)+(17´).................................................122 2.2 DARSTELLUNG VON (E)-1,3-BIS(TRIMETHYLSILOXY)-1-METHOXYBUTA-1,3-DIEN (15).....................123 2.3 DARSTELLUNG VON DIMETHYL 3-HYDROXYHOMOPHTHALAT (12)..................................................124 2.4 DARSTELLUNG VON SUBSTANZ (20)...............................................................................................128 2.5 DARSTELLUNG VON METHYL 1,8-DIHYDROXY-2-(METHOXYCARBONYL)-3-NAPHTHYL-ACETAT......130 2.6 DARSTELLUNG DER VERBINDUNG (22)...........................................................................................131 2.7 DARSTELLUNG DER SUBSTANZ (23)...............................................................................................133 3. STREPTOMYCES SP 106...............................................................................................................135 3.1 KULTIVIERUNG DES STAMMS.........................................................................................................135 3.2 RIMOCIDIN (33).............................................................................................................................136 3.3 DERIVATISIERUNG DER BEIDEN MAKROPOLYENE...........................................................................137 3.3.1 Acetylierung der Aminogruppe am Zucker.............................................................................137 3.3.2 Amidierung der Carbonsäuregruppe zum Derivat (37)...........................................................138 3.4 RIMOCIDIN-DERIVAT (37)..............................................................................................................139 Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________ 3.5 SUBSTANZ 2 (32)..........................................................................................................................142 3.6 TEST AUF FUNGIZIDE WIRKUNG.....................................................................................................145 4. MIMOSIN (40)..................................................................................................................................146 4.1 ALLGEMEINE ISOLIERUNG VON MIMOSIN (40) UND 3,4-DIHYDROXYPYRIDIN (41)...........................146 4.2 MIMOSIN (40)...............................................................................................................................147 4.3 3,4-DIHYDROXYPYRIDIN (41)........................................................................................................148 4.4 EINBAUVERSUCH MIT [U-14C-L-LYSIN]..........................................................................................149 4.5 EINBAUEXPERIMENT MIT [2-13C]-DL-LYSIN*2HCL........................................................................150 4.6 ABBAU VON MIMOSIN (40) NACH ADAMS......................................................................................150 4.7 EINBAUEXPERIMENT VON RADIOAKTIVEM LYSIN MIT ABBAU VON MIMOSIN ZU 3,4- DIHYDROXYPYRIDIN...........................................................................................................................151 4.8 EINBAUEXPERIMENT NACH HYLIN.................................................................................................151 C. LITERATUR....................................................................................................................................152 Einleitung 1 ______________________________________________________________ A. Theoretischer Teil 1. Allgemeine Einführung 1.1 Einleitung Wir befinden uns am Beginn eines neuen Jahrtausends, in dem ein Wandel der Wissenschaft stattfindet, der besonders durch die Informationstechnologie stark gefördert wird. Die Verfügbarkeit von Informationen aus verschiedenen klassischen Wissen- schaftsgebieten wie der organischen Synthese, Biochemie, Molekularbiologie, Genetik und der Verfahrenstechnik unter Verwendung von Bakterien, Pilzen, Zell- und Gewebekulturen ergibt neue aufstrebende Wissenschaftsfelder wie die Bio- technologie. Das breite Spektrum der Anwendungsmöglichkeiten und das wirtschaftliche Po- tential der Biotechnologie reicht von der Medizin und der Pharmazie über die Chemie und den Pflanzenschutz bis hin zum Umweltschutz und der Gewinnung neuer Energieträger aus nachwachsenden Rohstoffen. Enzyme werden beispielsweise immer öfter in chemischen Prozessen eingesetzt. Ihre hohe Chemo-, Regio- und Stereoselektivität bei milden Reaktionsbedingun- gen in Kombination mit einer stetig steigenden kommerziellen Verfügbarkeit zu akzeptablen Preisen macht diese Biokatalysatoren zu einer attraktiven Alternative zu chemischen Katalysatoren und kann desweiteren zur Herstellung neuer Sub- stanzen dienen[1]. In der Pflanzenbiotechnologie werden heute schon Nutzpflanzen hergestellt, wel- che eine Resistenz gegen Pilze oder Insekten aufweisen. Die dadurch verbesser- ten Erträge und Einsparungen bei Pflanzenschutzmitteln sind enorm. Einleitung 2 ______________________________________________________________ Der am schnellsten wachsende Teil der Biotechnologie ist der Medizin/Pharma- bereich. Hier bieten die Molekularbiologie und Genetik die Möglichkeit durch Veränderung der Gene von Bakterien, Pilzen und Pflanzen neue Substanzen her- zustellen, welche besonders für die Pharmaindustrie von Interesse sind. Man bezeichnet dieses Prinzip als kombinatorische Biosynthese. Sie gründet sich auf der Neukombination der Biosynthesegene und führt zu völlig neuen „unnatürli- chen“ Naturstoffen. Eine Studie des National Cancer Institute (NCI) belegt die Bedeutung von Natur- stoffen für die Arzneimittelentwicklung, wobei ganze Therapiebereiche ohne die Anregung aus der Naturstoffforschung völlig brach liegen würden[2]. Ein erfolgversprechendes Beispiel für die Suche nach Wirkstoffen ist das Zytosta- tikum Taxol (1) aus der Rinde einer pazifischen Eibenart (taxus brevifolia). Diese Entdeckung von (1) hat die Wirkstoffsuche in Pflanzen immer stärker in den Vor- dergrund gerückt. Im Pflanzenbereich läßt dabei vor allem die große Artenvielfalt des Meeres, insbesondere die der Algen auf ein großes, noch weitgehend unaus- geschöpftes Potential für neue Wirkstoffe bzw. Leitstrukturen hoffen[3]. Abb. 1: Taxol (1) O O O O OH H C CH 3 3 H C NH 3 CH 3 O H C 3 O O HO HO O O O O H C 3 Taxol (1) Einleitung 3 ______________________________________________________________ Der klinische Bedarf an Taxol (1) wird mittlerweile durch Semisynthese ausge- hend von einer Taxol-Vorstufe abgedeckt, die man aus Nadeln einer europäi- schen Eibenart erhält. Mittlerweile konnte Taxol (1) auch durch Totalsynthesen hergestellt werden, doch diese sind im Vergleich zu den Partialsynthesen oder auch zu der Isolierung aus natürlichen Quellen aufwendiger und teurer[4-6]. Am Anfang der Untersuchung eines Naturstoffes steht fast immer die Frage nach dessen chemischer Struktur und der Biogenese, d.h. die Suche nach den Grundbausteinen, aus denen der Naturstoff aufgebaut ist. Sie ist die Voraussetzung für eine weitergehende Erforschung der beim Aufbau ablaufenden Biosynthesemechanismen und der an den Reaktionen beteiligten Enzymen. Die Untersuchung sowohl der Biogenese als auch der Biosynthese findet zumeist anhand von Einbauexperimenten mit hypothetischen Vorläufern der Naturstoffe statt, die entweder mit radioaktiven (beispielsweise 14C, 32P oder 3H) oder stabilen (z.B. 13C, 18O ,15N oder 2H) Isotopen angereichert sind. Beide Markierungsmethoden haben ihre Vor- und Nachteile. Während die Markie- rungen mit stabilen Isotopen eine ungefährliche Handhabung erlaubt, wird die Verwendung radioaktiver Isotope durch die hierbei notwendigen Sicherheitsvor- kehrungen erschwert. Die Markierung mit radioaktiven Isotopen besitzt den Vor- teil, daß aufgrund der hohen Nachweisempfindlichkeit der Strahlung auch noch bei sehr geringen Substanzmengen bzw. Einbauraten eine Detektion möglich ist. Um Informationen über den Einbauort zu erhalten, sind aber oftmals Abbaureak- tionen notwendig, die sich insbesondere bei geringen Substanzmengen als schwierig erweisen. Die bei den stabilen Isotopen vorteilhafte Detektion mit Hilfe der NMR-Spektro- skopie erfordert bedingt durch die zum Teil schlechten Einbauraten und die relative Unempfindlichkeit dieser Messmethode die Verwendung größerer Men- gen an Vorläufern. Wird eine isotopenmarkierte Verbindung nicht in den zu untersuchenden Natur- stoff eingebaut, muß überprüft werden, ob sie die Zellwand überhaupt passieren und an den Stoffwechselvorgängen teilnehmen kann. Ist dies nicht der Fall, müs- sen bei einer Fütterung die Zellwände durch chemische oder mechanische Einflüsse passierbar gemacht werden. Es kann sogar die Entwicklung eines zell- Einleitung 4 ______________________________________________________________ freien Systems notwendig werden. Um Fragen bezüglich des Reaktionsmechanis- musses von Enzymen zu klären, können Synthesen von direkten Vorläufersub- stanzen durchgeführt oder Enzymreaktionen imitiert werden.