RRREEEPPPUUUBBBLLLIIIQQQUUUEEE AAALLLGGGEEERRRIIIEEENNNNNNEEE DDDEEEMMMOOOCCCRRRAAATTTIIIQQQUUUEEE EEETTT PPPOOOPPPUUULLLAAAIIIRRREEE MMMIIINNNIIISSSTTTEEERRREEE DDDEEE LLL'''EEENNNSSSEEEIIIGGGNNNEEEMMMEEENNNTTT SSSUUUPPPEEERRRIIIEEEUUURRR EEETTT DDDEEE LLLAAA RRREEECCCHHHEEERRRCCCHHHEEE SSSCCCIIIEEENNNTTTIIIFFFIIIQQQUUUEEE UUNNIIVVEERRSSIITTEE AABBOOUU BBEEKKRR BBEELLKKAAIIDD TTLLEEMMCCEENN FFFAAACCCUUULLLTTTEEE DDDEEESSS SSSCCCIIIEEENNNCCCEEESSS DDDEEE LLLAAA NNNAAATTTUUURRREEE EEETTT DDDEEE LLLAAA VVVIIIEEE DDDEEE LLLAAA TTTEEERRRRRREEE EEETTT DDDEEE L’UNIVERS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Laboratoire dddeee MMMiiicccrrrooobbbiiiooolllooogggiiieee AAAppppppllliiiqqquuuéééeee ààà lll’’’AAAgggrrroooaaallliiimmmeeennntttaaaiiirrreee,,, aaauuu BBBiiiooommmééédddiiicccaaalll eeettt ààà lll’’’EEEnvironnement « LAMAABE » THESE Présentée par : MMmmee MM’’HHaammeeddii IImmaannee eepp AAbboouurraa EEnn vvuuee ddee ll’’oobbtteennttiioonn dduu ddiippllôômmee ddee DDooccttoorraatt eenn BBiioollooggiiee Option : Microbiologie EEvvaalluuaattiioonn ddee llaa ffoorrmmaattiioonn ddee bbiiooffiillmmss ddeess ssoouucchheess dd’’AAcciinneettoobbaacctteerr baumannii iiisssooollléééeeesss dddeee dddiiissspppooosssiiitttiiifffsss mmmééédddiiicccaaauuuxxx aaauuu CCCHHHUUU dddeee TTTllleeemmmccceeennn Soutenu le …/…/… Devant le jury Président BBoouucchheerriitt OOttmmaannii ZZ.. Professeur UU.. ddee TTlleemmcceenn Directrice de thèse HHaassssaaiinnee HH.. Professeur UU.. ddee TTlleemmcceenn Examinateur AAbbddeelloouuhheedd DD.. EE.. Professeur UU.. ddee TTlleemmcceenn Examinateur DDjjeerriibbii RR.. Professeur UU.. dd’’AAnnnnaabbaa Examinateur BBeellllaahhcceenn M. Professeur CC..UU.. dd’’AAiinn témouchent Examinateur BBaaddssii AAmmiirr SS.. Docteur CCHHUU ddee SSiiddii bbeell AAbbbbèèss Année Universitaire : 2014-2015 Remerciements Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de microbiologie appliquée à l’agroalimentaire, au biomédicale et à l’environnement (LAMAABE), université Abou Bekr Belkaid de Tlemcen. Je tiens particulièrement à remercier son directeur le professeur Moussa- Boudjemaa Boumediène de m’y avoir accueilli. J’exprime ma profonde gratitude à ma directrice de thèse, Madame le professeur Hassaine Hafida de l’université Abou Bekr Belkaid sans qui rien ne serai la aujourd’hui, pour la confiance qu’elle m’a accordé en me proposant ce sujet et d’avoir contribué à sa réalisation dans les conditions les plus extrêmes sans jamais baisser les bras. Je lui suis reconnaissante pour sa disponibilité, son dévouement et la compréhension dont elle a fait preuve dans les moments difficiles. Veuillez trouver ici, cher professeur, l’expression de ma profonde estime. Je suis très sensible à l'honneur que me fait Madame le professeur Boucherit-Otmani Zahia, de l’université Abou Bekr Belkaid de Tlemcen qui me fait le grand honneur de présider le jury. Je lui adresse mes sincères remerciements. Je remercie Monsieur le professeur Adbelouahid Djamel Eddine de l’université Abou Bekr Blekaid Tlemcen de faire partie du jury de cette thèse. Je l'assure de ma profonde gratitude, ainsi que de ma sincère reconnaissance. Je tiens a remercier Monsieur le professeur Djeribi Ryad de l’université Badji Mokhtar d’Annaba, non seulement pour avoir accepté de juger ce travail mais également pour m’avoir aidé à le réaliser. Je vous suis reconnaissante d’avoir accepté de m’accueillir dans votre laboratoire et de m’avoir permis de bénéficier de vos précieux conseils, votre savoir faire et votre rigueur. Je garderai pour toujours de vous la meilleure des impressions. J’adresse mes plus vifs remerciements à Monsieur le professeur Belahcen Miloud du centre universitaire d'Ain Témouchent qui m’a fait l’honneur d’examiner cette thèse de doctorat. Je tiens à exprimer ma sincère gratitude à Madame le docteur Badsi Amir Souad du CHU de Sidi bel Abbès, pour l’intérêt qu’elle a porté à ce travail en acceptant d’en être l’une des examinatrices. Dédicaces Avec l’aide de Dieu tout puissant et tous les gens qui m’aiment et qui m’ont soutenu j’ai pu achever ce modeste travail que je dédie à : A toi Islem, mon cher frère qui vient de nous quitter, tu me manqueras comme si une partie de moi-même venait de m'abandonner. Ta tendresse, ton amour, ta gentillesse et ton sourire qui illuminait nos vies me manqueront à tout jamais. J’aurai tant voulu que tu puisses voir le fruit de tant d’années de travail pour être fier de ta petite sœur ; malheureusment je n’ai pas eu cette chance mais je sais que tu aurais été heureux pour moi car ton grand cœur ne saurait que l’être. À la fois, je me sens tellement triste en évoquant ta mémoire, à la fois, je relève la tête et je souris car désormais, attendre en espérant te rejoindre un jour dans le vaste paradis est la seule chose qui me fait tenir (je t’aime mon frère). A mes parents, A celle qui m’est la plus chère au monde, qui a su partager chaque moment de mon existence avec son intarissable tendresse, à celle à qui je dois le meilleur de moi même. C’est à toi maman, que je dédie aujourd’hui le fruit de ton dévouement, en espérant être à la hauteur de tes sacrifices. A mon cher papa, nulle dédicace, aucun mot, ne saurait exprimer réellement, mon profond amour, mon respect et ma reconnaissance pour tous les sacrifices que tu as prodigué pour ma formation, ma réussite et mon bien être. A celui qui partage ma vie dans le meilleur et dans le pire, mon époux Nacer, merci de m’avoir encouragé tous le long de ce travail, sans ta patience et ta compréhension ce travail n’aurait jamais vu le jour. Que dieu te garde pour moi. A ma petite fille Lilia, mon rayon de soleil et ma raison d’être, merci d’illuminer ma vie dans les moments les plus difficile. A ma sœur Téma, qui a su me soutenir dans les moments les plus difficiles de ma vie je te remercie d’être toujours là pour moi. Rien ne saurait exprimer tous les sentiments que je te porte. Que dieu te garde pour moi. A ma belle sœur Djidja, mon neveu Yacine et mon beau frère Nadir, merci de faire partie de ma vie. A ma belle famille pour leur compréhension et encouragement. A toute ma famille, ma chère grand-mère, oncles, tantes, cousines, cousins et à tous ce qui ont rendu ma vie agréable. A mes amies Meriem, Samia, Ibtissem, Nabila, Nassima, Asma et Wafaa, pour tous les bons moments ainsi que les moments de désespoir que nous avons partagé. A tous les enseignants qui m’ont accompagné tous le long de mon parcours et qui m’ont appris tout ce que je sais aujourd’hui. Table des matières Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Introduction…………………………………………………………………………… 01 … Première partie : synthèse bibliographique…………………………………………… 03 Chapitre 1 : Les caractéristiques du genre Acinetobacter spp………........................... 03 1. Taxonomie…………………………………………………………………………….. 03 .2…. C...a. ractères bactériologiques……………………………………………………............ 04 2.2.Caractères morphologiques………………………………………………............. 04 2.3.Caractères culturaux……………………………………………………………… 05 3. Caractères biochimiques………………………………………………………………. 05 4. Habitat…………………………………………………………………………………. 05 5. E…pi.d. émiologie…………………………………………………………………………. 06 6. A…. b..a. u mannii et infections associées aux soins……………………………………….. 06 6.1.Pneumopathies acquises sous ventilation………………………………………… 07 6.2. Lmeés cbaancitqéureié…m…ies… as…so…cié…es… au…x …cat…hé…ter…s…...… ……………………………………. 07 66..33..L veass cinufleacirteios…ns …as…soc…ié…es …au… so…nd…ag…e u…rin…ai.r..e … …………………………………... 08 6.4.Méningites………………………………………………………………………... 08 6.5..I n fection de la peau………………………………………………………………. 08 Chapitre 2 : Les facteurs de virulence chez A. baumannii……………………………. 09 1. Le biofilm……………………………………………………………………………… 09 1.1.Définition et étapes de formation du biofilm.……………………………………. 10 1.2. Propriété du biofilm……………………………………………………………... 12 1.2.1. Résistance aux antibiotiques………………………………………………… 12 1.2.2. La résistance à l’immunité………………………………………………… 13 1.2.3. Rapidité d’acquisition d’éléments génétiques……………………………….. 13 1.3. Les facteurs influençant la formation de biofilm d’A. baumannii………………. 13 1.3.1. Les propriétés bactériennes………………………………………………… 13 1.3.1.1. L’hydrophobicité………………………………………………………. 13 1.3.1.2. Le pili………………………………………………………………….. 13 1.3.1.3. La protéine Bap (biofilm-associated protein…………………………… 14 1.3.1.4. Le poly-β-1,6-N-acétylglucosamine (PNAG)…………………………. 15 1.3.2. Les caractéristiques de la surface du dispositif médical……………………. 15 1.3.2.1. La nature du matériau………………………………………………….. 15 11..33..22..22.. LLaa cchhaarrggee ddee ssuurrffaaccee eett llee ccaarraaccttèèrree hhyyddrroopphhoobbee ddeess mmaattéérriiaauuxx… …….. 16 1.3.2.3.1 .3.2. 4. La rugosité de la surface……………………………………………... 16 1.3.2.5. Présence de films protéiques sur la surface………………………........ 16 1.3.3. Les caractéristiques du milieu aqueux……………………………………… 17 1.4. Autres facteurs de virulence……………………………………………………... 17 1.4.1. La résistance aux antibiotiques……………………………………………… 17 1.4.2. Les lipopolysaccharide (LPS)……………………………………................ 18 1.4.3. La protéine de membrane externe A (OmpA)…………………………….. 18 1.4.4. Le quorum sensing……………………………………………………….. 19 1.4.5. L’activité enzymatique…………………………………………………...... 19 1.4.6. La régulation de fer………………………………………………………… 19 Deuxième partie : Matériel et méthodes……………………………………………….. 20 1. Prélèvements………………………………………………………………………..… 20 2. .E nsemencement………………………………………………………………………. 20 3. .I.d entification………………………………………………………………………….. 20 4. .S ensibilité aux Antibiotiques…………………………………………………………. 20 5. Etude de la formation de biofilm d’Acinetobacter baumannii……………………….. 21 5.1. La méthode tube (TM)………………………………………………………….. 21 5.2. La méthode de Plaque de culture de tissus (TCP)……………………………….. 21 6. Etude de l’hydrophobicité de la paroi bactérienne d’A. baumannii…………………….. 22 6.1. La méthode MATH (Microbial Adhesion to Hydrocarbure)……………………. 22 6.2. Le test d’agglutination ou le Salt Aggregation Test (SAT)……………………… 22 7. Etude de la formation de biofilm d’A. baumanii sous conditions de culture………… 23 8. 7C.i1n.é tique de la formation de biofilm d’A. baumannii………………………………... 23 9. Etude de la formation de biofilm d’A. baumannii sur différents biomatériaux………. 23 9.1. Préparation des supports…………………………………………………………. 23 9.2. Détermination de l’hydrophobicité de la surface des substrats solides………….. 23 9.3. Adhésion d’A. baumannii sur le PVC, le silicone et le latex…………………… 24 9.4. Observation de l’adhésion par microscopie électronique environnemental à 25 balayage (ESEM)………………………………………………………………... Troisième partie : Résultats et discussion……………………………………………... 26 1. Prélèvements…………………………………………………………………………... 26 .2... Identification de l’espèce A. baumannii……………………………………………….. 28 3. Antibiogramme………………………………………………………………………... 31 .4…. E...v..a l uation de la formation de biofilm chez A. baumannii.…………………………… 32 5. Etude de l’hydrophobicité de la paroi bactérienne d’A.baumannii……………….. 36 6. Influence des conditions de culture sur la formation de biofilm d’A. baumannii…… 39 6.1. Influence de la température……………………………………………………….. 39 6.2. Influence du Glucose et du NaCl…………………………………………………. 40 7. Cinétique de la formation de biofilm chez A. baumannii…………………………… 43 8. Influence de la nature du dispositif médical sur la formation de biofilm par 45 A.baumannii………………………………………………………………………………. .C onclusion générale……………………………………………………………………... 49 Références bibliographiques……………………………………………………………. 51 Annexes Liste des abréviations A. baumannii : Acinetobacter baumannii AK : Amikacine CAZ : Ceftazidime CIP : Ciprofloxacine CL : Colistine DDJ : Dose Déterminée Journalière DO : Densité Optique EDS : Eau Distillé Stérile EPS : Exopolysaccharides GN : Gentamycine IMP : Imipenème JH : Jour d’Hospitalisation LB : Luria Bertani LPS : Lipopolysaccharide MATH : Microbial Adhesion to Hydrocarbure MEB : Microscope Electronique à Balayage PAVM : Pneumopathie Acquise sous Ventilation Mécanique PBS : Phosphate Buffered Saline Pip : Pipéracilline PVC : Poly chlorure de Vinyle SAT : Salting Agrégation Test SXT : Sulfaméthoxazole-triméthoprime TCC : Ticarcilline- acide clavulanique TCP : Méthode de Plaque de Culture de Tissus TE : Tétracycline TIC : Ticarcilline TM : Tobramycine TM : Méthode en Tube UFC : Unité(s) Formant Colonie(s) Liste des figures Figure 1: Visualisation d’A.baumannii sous microscope électronique à balayage…….. 05 Figure 2 : Microscopie électronique à bala yage du biofilm d’A. baumanii. A : sur le 10 verre B : sur sonde urinaire……………………………………………………………… Figure 3 : Représentation schématique des différentes étapes du développement d’un 11 biofilm bactérien………………………………………………………………………… Figure 4 : Formation de biofilm par A. baum annii. A : Déficient en Bap. B : expriment 14 la protéine Bap…………………………………………………………………………... Figure 5: Représentation de l’angle de cont act (θ) d’une goutte liquide déposée à la 24 surface…………………………………………………………………………………… Figure 6 : Appareil de mesure de l’angle de contact (GBX, France)…………………... 24 Figure 7 : Microscope électronique à balaya ge Hitachi TM1000……………………… 25 Figure 8 : Observation microscopique ap rès coloration de Gram (Grossissement x 28 100)……………………………………………………………………………………… Figure 9 : Taux de résistance aux antibiotiq ues des isolats d’A.baumannii……………. 32 Figure 10: Quantification de la formation de biofilm par A. baumannii en 33 microplaques à 37°C.……………………………………………………………………. Figure 11 : Dépistage de la production du b iofilm par la méthode TM et TCP………... 34 Figure 12 : Pourcentage d’affinité des souc hes d’A. baumannii a l’héxadecane………. 37 Figure 13 : Quantification de la formation de biofilm par A. baumannii en fonction de 40 lFai gteumrep é1r4a:t uIrnef…lue…nc…e d…u … gl…uc…os…e s…ur …la …fo…rm…ati…on… de… b…iof…ilm… p…ar… A.… ba…um…a…nn…ii……………….. 41 Figure 15 : Influence du NaCl sur la forma tion de biofilm par A. baumannii………… 42 Figure 16 : Cinétique de la formation de bio films chez A. baumannii…………………. 45 Figure 17 : Adhésion des souches d’A. ba umannii sur le latex, le silicone et le PVC 47 (UFC/mL) après 24h d’incubation………………………………………………………. Figure 18: Observation au MEB d’un biofi lm D’A. baumannii. (A-B) sur le PVC, (C- 47 D) sur le silicone, (E-F) sur le latex……………………………………………………... . Liste des tableaux Tableau 1 : Les espèces appartenant au genre Acinetobacter sp………………………. 04 Tableau 2: Résultats de la colonisation des dispositifs médicaux isolés……………….. 26 Tableau 3 : Répartition des souches d’A.baumannii selon l’âge……………………….. 29 Tableau 4 : Répartition des souches d’A.baumannii selon le sexe……………………... 29 Tableau 5 : Répartition des souches d’A.baumannii selon le site d’isolement……….... 30 Tableau 6 : Résultats de la formation du biofilm par la technique TM et TCP………... 33 Tableau 7 : Caractérisation des souches isolées de dispositifs médicaux infectés……... 35 Tableau 8 : Résultats du test SAT……………………………………………………… 37 Tableau 9 : Angle de contact des trois supports par rapport à l’eau…………………… 46