Mentale Retardierung bei Phenylketonurie: Einfluss erhöhter Phenylalaninspiegel auf die synaptische Konnektivität im Hippocampus Dissertation zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) des Fachbereichs Chemie der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Universität Hamburg vorgelegt von Gudrun Schlegel aus Freiburg im Breisgau Hamburg März 2015 II Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von April 2011 bis März 2015 im Institut für Neuroanatomie am Zentrum für Experimentelle Medizin des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf unter der Leitung von Prof. Dr. Gabriele M. Rune angefertigt. 1. Gutachterin: Prof. Dr. Elke Oetjen 2. Gutachterin: Prof. Dr. Gabriele M. Rune Tag der Disputation: 16.07.2015 III IV „The secret of genius is to carry the spirit of the child into old age, which means never losing your enthusiasm“ Aldous Huxley (1894 – 1963), brit. Schriftsteller V VI Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................ VII Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... XI Zusammenfassung ............................................................................................................. XV Summary ......................................................................................................................... XVII 1 Einleitung ......................................................................................................................... 1 1.1 Phenylketonurie, eine Einführung .......................................................................... 1 1.1.1 Geschichte .............................................................................................................. 1 1.1.2 Inzidenzzahlen ....................................................................................................... 1 1.1.3 Genotyp und Phänotyp ........................................................................................... 2 1.1.4 Folgen des Enzymdefekts ...................................................................................... 2 1.1.5 Therapie ................................................................................................................. 4 1.2 Der Hippocampus und seine Funktion ................................................................... 5 1.2.1 Regionen des Hippocampus ................................................................................... 5 1.2.2 Dreischichtigkeit des Hippocampus ....................................................................... 6 1.2.3 Die Zellen des Hippocampus ................................................................................. 6 1.2.4 Neuronale Verschaltung des Hippocampus ........................................................... 8 1.2.5 Funktion des Hippocampus .................................................................................... 9 1.3 Das Neuron ............................................................................................................. 10 1.3.1 Aufbau einer Nervenzelle .................................................................................... 10 1.3.2 Aufbau und Regulation des Zytoskeletts ............................................................. 11 1.3.3 Synaptische Übertragung ..................................................................................... 13 1.4 Mikroglia und synaptisches Pruning .................................................................... 15 1.5 Derzeitiger Wissensstand: Mentale Retardierung in PKU ................................ 17 1.6 Aufgabenstellung der Arbeit ................................................................................. 19 2 Ergebnisse ...................................................................................................................... 23 2.1 Phenylalanin hat keinen Effekt auf die Vitalität hippocampaler Neurone ...... 23 2.2 Phenylalanin beeinflusst in-vitro die Dendritogenese ......................................... 24 2.2.1 Charakterisierung des Dendritenbaums nach Phenylalaninbehandlung .............. 25 2.2.2 Charakterisierung des proximalen Dendritenbaums ............................................ 26 VII Inhaltsverzeichnis 2.3 Einfluss von Phenylalanin auf das Axonwachstum ............................................. 28 2.4 Beeinflussung der synaptischen Konnektivität durch Phenylalanin ................. 31 2.4.1 Phenylalanin beeinflusst direkt die Entwicklung von Spinesynapsen ................. 31 2.4.2 Phenylalanin beeinflusst die in-vitro Spinogenese .............................................. 33 2.4.3 Phenylalanin beeinflusst die Expression der präsynaptischen Proteine Synaptophysin, Synaptobrevin und Snap-25 ....................................................... 35 2.4.4 Phenylalanin beeinflusst die Expression des postsynaptischen Proteins Spinophilin, nicht jedoch die Expression von Synaptopodin .............................. 38 2.5 Beeinflussung der Signaltransduktion durch Phenylalanin ............................... 41 2.5.1 Phenylalanin beeinflusst die Aktivität des Aktin-assoziierten Proteins Cofilin .. 41 2.5.2 Phenylalanin beeinflusst die Aktivität der GTPase Rac1 .................................... 45 2.5.3 Phenylalanin beeinflusst die Aktivität der CaMKII ............................................. 46 2.6 Beeinflusst Phenylalanin die Aktivität von Mikroglia? ...................................... 49 2.6.1 Reduzierte Aktivität von Mikroglia in adulten Pahenu2 Mäusen .......................... 50 2.6.2 Reduzierte mRNA Level in der Pahenu2 Maus ..................................................... 51 2.6.3 Einfluss von Phenylalanin auf die Mikrogliaaktivität .......................................... 52 3 Diskussion ...................................................................................................................... 55 3.1 Phenylalanin hat einen direkten Einfluss auf die Entwicklung hippocampaler Neurone in-vitro ...................................................................................................... 55 3.2 Phenylalanin beeinflusst die Expression präsynaptischer Proteine .................. 59 3.3 Phenylalanin beeinflusst die postsynaptische Proteinexpression ...................... 61 3.4 Phenylalanin beeinflusst das Aktinzytoskelett .................................................... 63 3.5 Phenylalanin beeinflusst dosisabhängig den CaMKII-Rac1-vermittelten Signalweg ................................................................................................................ 65 3.6 Mikroglia sind am verzögerten synaptische Pruning in PKU beteiligt ............. 67 3.7 Zusammenfassung .................................................................................................. 69 4 Material und Methoden ................................................................................................ 71 4.1 Material ................................................................................................................... 71 4.1.1 Versuchstiere ........................................................................................................ 71 4.1.2 Zellkultur .............................................................................................................. 71 4.1.3 Antikörper ............................................................................................................ 72 4.1.4 Bakterienstämme .................................................................................................. 73 4.1.5 Vektoren ............................................................................................................... 74 VIII Inhaltsverzeichnis 4.1.6 Oligonukleotide .................................................................................................... 74 4.1.7 Restriktionsenzyme .............................................................................................. 74 4.1.8 Größenstandards ................................................................................................... 75 4.1.9 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ............................................................. 75 4.1.10 Kits ....................................................................................................................... 76 4.1.11 Geräte ................................................................................................................... 76 4.1.12 Software ............................................................................................................... 78 4.2 Methoden ................................................................................................................ 78 4.2.1 Zellbiologische Methoden .................................................................................... 78 4.2.1.1 Primäre hippocampale Dispersionskultur .................................................... 79 4.2.1.2 Hippocampale organotypische Gewebekultur ............................................. 80 4.2.1.3 Immortalisierte Zelllinie HEK-293 .............................................................. 80 4.2.1.4 Mediumwechsel und Phenylalaninstimulation ............................................ 81 4.2.1.5 Kurzzeitstimulation mit NMDA .................................................................. 81 4.2.1.6 Transfektion mit Effectene® Transfektionsreagenz .................................... 82 4.2.1.7 Transiente Transfektion durch Kalzium-Phospat-Präzpitation .................... 82 4.2.1.8 Fixierung der Kulturen ................................................................................. 83 4.2.1.9 Herstellung von Zelllysaten für Proteinanalysen ......................................... 84 4.2.2 Pahenu2 Maus ........................................................................................................ 85 4.2.2.1 Genotypisierung der Pahenu2 Maus .............................................................. 85 4.2.3 Elektronenmikroskopie ........................................................................................ 86 4.2.3.1 Fixierung des Gewebes für die Elektronenmikroskopie .............................. 86 4.2.3.2 Eponeinbettung ............................................................................................ 86 4.2.3.3 Aufnahmen mit TEM und Bildanalyse ........................................................ 88 4.2.4 Immunhistochemische Methoden ........................................................................ 88 4.2.4.1 Immuncytochemie ........................................................................................ 89 4.2.4.2 Fluoreszensmikroskopie und Intensitätsanalyse .......................................... 89 4.2.4.3 Apoptosenachweis mittels TUNEL-Assay .................................................. 90 4.2.4.4 Sholl-Analyse ............................................................................................... 91 4.2.4.5 Proximaler Dendritenabschnitt .................................................................... 91 4.2.4.6 Evaluierung der Spinedichte und -morphologie .......................................... 91 4.2.5 Molekularbiologische Methoden ......................................................................... 92 4.2.5.1 Agarose-Gelelektrophorese .......................................................................... 92 4.2.5.2 Extraktion und Reinigung von mRNA ........................................................ 92 IX